ShRNA-plasmidien suunnittelu ja valmistaminen

Kysymykseen, miten shRNA-sekvenssi korreloi knockdownin tehokkuuden kanssa, suunniteltiin ja rakennettiin 27 shRNA-vektoria 11:ltä erilaiselta geeniltä (taulukko 1). Kohdejaksot valittiin kunkin geenin koodaavalta alueelta, ja ne suunniteltiin siten, että ne vastasivat pitkälti seminaalisissa tutkimuksissa siRNA-oligomeerin tehoon vaikuttavia sekvenssiominaisuuksia . Näin ollen sekvensseissä on vähän juoksutuksia ja niiden G/C-suhde on noin 50 %. ShRNA:t suunniteltiin kohdekohtiin, joissa ei ole yhden nukleotidin polymorfismeja, ja ne vastaavat kaikkia splice-variantteja, jotka monistettiin reaaliaikaisilla PCR-alukesarjoillamme.

Koska siRNA:lla voi olla kohteen ulkopuolisia vaikutuksia, toiminnallisissa kokeissa on tärkeää valmistaa kontrollina spesifinen mutantti, jossa on yksi tai useampi emäsvirhe kohdetunnistuskohdan sisällä . Ajan ja kustannusten säästämiseksi olemme kehittäneet menetelmän, jolla voimme valmistaa villityyppisiä ja mutanttisia shRNA-vektoreita samanaikaisesti (yksityiskohtaiset tiedot menetelmissä ja kuvassa 1). Geenien knockdown-tulokset neljästä villityyppi/mutanttinen shRNA-parista esitetään kuvassa 2. Nämä tulokset osoittavat tämän menetelmän käyttökelpoisuuden sellaisen pistemutanttisen shRNA-vektorin tuottamisessa, joka voi toimia toimintakyvyttömyyskontrollina villityyppisten shRNA:iden suorittamalle geenin tyrmäykselle. Vaikka shRNA-vektoreiden rakentamisesta on julkaistu yksityiskohtaisia protokollia , tämä on ensimmäinen protokolla, jolla tuotetaan samanaikaisesti villin tyypin ja mutanttivektoreita, ja sen pitäisi helpottaa hyvin kontrolloidun shRNA-järjestelmän toteuttamista.

Strategia tarkkaa sekvensointia varten hiusnauharakenteiden kautta

ShRNA-hiusnauhan sekvenssin tarkistaminen on olennaista, koska yhdenkin nukleotidin epäsopivuus kohdesekvenssissä voi mitätöidä tyrmäyksen (kuva 2 ja .) ShRNA-vektoreiden valmistuksessa kohdataan usein se ongelma, että monet niistä ovat vaikeasti sekvensoitavissa hiusnauhan luontaisen sekundäärirakenteen vuoksi. Yksi hiljattain ehdotettu strategia tämän ongelman ratkaisemiseksi käsittää rajoituskohdan suunnittelun hiusneulan silmukan/vartalon alueella, jotta invertoidut toistot voidaan fyysisesti erottaa toisistaan sulattamalla, ja sen jälkeen sekvenssin kokoaminen yhteen käyttämällä sense- ja antisense-alkukkeita . Olisi kuitenkin selvää etua siitä, että shRNA-konstruktioiden sekvensointi olisi mahdollista ilman stem/loop-sekvenssin muuttamista. Tämän mahdollisuuden käsittelemiseksi arvioimme modifioituja sekvensointireaktioita hiusneulan sekundäärirakenteen lukemisen parantamiseksi kolmessa shRNA-hiusneulassa. Modifikaatioihin kuuluu DNA:n rakennetta rentouttavien aineiden, kuten DMSO:n, betaiinin, PCRx Enhancerin ja ThermoFidelase I:n, lisääminen sekä dGTP BigDye-terminaattorikemian (dGTP) lisääminen kasvavissa määrin BigDye v1.1 (BD) -vakiokemiaan, joka sisältää dITP:tä dGTP:n sijaan.

Sekvensointitulokset kustakin kolmesta DNA-konstruktiosta on koottu yhteenvetona taulukkoon 2. Hiusnauharakenteen läpilyönti mitattiin noin 300 emästä hiusnauharakenteen jälkeen olevan piikin korkeuden ja noin 50 emästä ennen hiusnauharakennetta olevan signaalin suhteena. Suhde 1 tarkoittaa, että signaalia ei ole hävinnyt ja 0 tarkoittaa, että läpilyönti on hävinnyt kokonaan. Kun BD-kemiaan ei lisätty mitään lisäainetta, hiusneula aiheutti vähemmän tiukasti rakennetun hiusneulan, pHSPG-shmutTLR4:n, piikin korkeussuhteen pienenemisen 0,4:ään ja täydellisen luettavuuden menetyksen kahdessa muussa plasmidissa. Tämä voidaan havainnollistaa pHSPG-shTLR4:n sekvenssipiikkiprofiilin äkillisenä pysähtymisenä (kuva 3A).

DNA:ta relaksoivista aineista 5 %:n DMSO, 0,83 M:n betaiini ja 1 × PCRx Enhancer paransivat kumpikin merkittävästi sekvenssilukemia joidenkin konstruktioiden osalta. Kuitenkin 0,83 M betaiinin ja 1 × PCRx Enhancerin lisäämisen BD-kemiaan havaittiin sekvensoivan johdonmukaisimmin, ja piikin korkeussuhteet olivat 0,5-0,9 (taulukko 2 ja kuva 3B). Myös pelkän 10:1 BD:dGTP-kemian lisääminen paransi jonkin verran lukemista, jolloin piikin korkeussuhteet olivat 0,5-0,6 (taulukko 2 ja kuva 3C). Epäoptimaalinen piikin korkeussuhde 10:1 BD:dGTP:llä voidaan selittää sekvenssipiikkiprofiilissa sekundäärirakennealueen jälkeen näkyvällä portaalla, jossa signaali vähenee (kuva 3C, nuoli). Lisäämällä dGTP-kemian pitoisuutta 5:1:een ja 3:1:een BD:dGTP:hen tai käyttämällä pelkkää dGTP-kemiaa parannettiin piikin korkeussuhdetta ja vähennettiin askelta jonkin verran (suhde 0,6-0,8). Kuitenkin dITP:n ja dGTP:n sekamuotoinen sisällyttäminen johti pahempaan piikin levenemiseen, kun käytetyn dGTP:n määrä kasvoi, ja pelkkä dGTP-kemia aiheutti vakavia sekvenssin puristumia (tietoja ei ole esitetty). Parhaat kokonaistulokset saatiin yhdistämällä betaiini plus PCRx ja 10:1 BD:dGTP sekakemia yhdessä. Tämä yhdistelmä pienensi askelta, jolloin piikin leveneminen oli vähäisempää ja piikin korkeussuhteet kasvoivat 0,9-1,0:een (taulukko 2 ja kuva 3D). ThermoFidelase I, DNA:ta destabiloiva entsyymi, jota käytetään usein parantamaan genomisen DNA:n sekvensointia , ei parantanut minkään kolmen hiusneulan sekvensointia suorassa BD-kemiassa (tietoja ei ole esitetty), ja itse asiassa se pienensi piikin korkeussuhdetta merkittävästi 10:1 BD:dGTP-kemiassa kaikkien kolmen shRNA-konstruktion kohdalla aiheuttaen pysähdyksen uudelleen hiusneulan rakenteen kohdalla (taulukko 2 ja kuva 3E).

Yhteenvetona voidaan todeta, että 10:1 BD:GTP-kemioiden, 0,83 M betaiinin ja 1 × PCRx Enhancerin yhdistelmällä saatiin aikaan optimaalinen sekvensointi, ja sekoitetuilla BD:dGTP-kemioilla, betaiinilla, PCRx Enhancerilla ja DMSO:lla oli kullakin jonkin verran myönteisiä vaikutuksia yksinään. ThermoFidelase I:tä tulisi kuitenkin luultavasti välttää shRNA-vektoreille, joilla on vaikea luontainen sekundäärirakenne.

Korrelaatio shRNA:n knockdown-tehokkuuden ja julkaistujen algoritmien välillä siRNA-suunnittelua varten

Tarkistaaksemme, korreloiko shRNA-vektoreiden knockdown-tehokkuus julkaistujen sääntöjen kanssa, jotka koskevat tehokkaiden siRNA-oligonukleotidien suunnittelua, arvioitiin shRNA:iden kykyä tyrmätä geeniulostuma. ShRNA:t transdusoitiin stabiilisti joko THP1- tai Jurkat-ihmissolulinjoihin taulukon 3 kahden ensimmäisen sarakkeen mukaisesti. Keskimääräinen knockdown määritettiin kolmelta tai useammalta eri päivältä kerätystä RNA:sta, ja se on lueteltu kunkin shRNA:n osalta (sarake 3). Knockdown osoittautui toistettavaksi solulinjoissa, jotka transduktoitiin ja lajiteltiin toisistaan riippumatta, mikä viittaa siihen, että knockdown on pikemminkin shRNA:n kohdesekvenssin kuin virustransduktion ominaisuuksien funktio. Yli kolmannes rakennetuista shRNA-vektoreista ei kyennyt tukahduttamaan transkriptiota (<10 % sarakkeessa 3) huolimatta vertailukelpoisista kasvunopeuksista ja GFP-merkkiaineen pitkäaikaisesta ilmentymisestä korkeilla tasoilla näissä solulinjoissa. Lisäksi useiden samoja geenejä (esim. CLR16.2, CLR19.3 ja TLR4) vastaan tehtyjen useiden shRNA-vektoreiden knockdown-tehokkuuden suuret erot puhuvat sitä vastaan, että näiden geenien tehokkuuserot johtuisivat yksinkertaisista biologisista syistä. Monilla tehottomista shRNA:ista on negatiiviset 5′ ΔΔG-arvot ja korkea Reynoldsin pisteytys, joiden kummankin on oletettu korreloivan siRNA:n knockdown-tehokkuuden kanssa (taulukko 3, sarakkeet 4 ja 5) . Sitä vastoin niiden shRNA:iden joukossa, jotka kykenivät antamaan geenin knockdownin, useilla oli joko positiiviset 5’ΔΔG-arvot tai matalat Reynoldsin pisteet. Nämä havainnot osoittavat, että siRNA:n 5’ΔΔG- ja Reynoldsin pisteytysalgoritmi eivät ehkä tarjoa positiivisia korrelatiivisia kriteerejä shRNA:n suunnittelua varten.

Mutta sen selvittämiseksi, voidaanko muita julkaistuja algoritmeja siRNA-oligonukleotidien suunnittelua varten soveltaa shRNA-vektoreihin, kukin shRNA:n kohdekohde arvioitiin neljällä muulla algoritmilla, ja pistemäärät piirrettiin kaavioina kunkin shRNA:n prosenttimääräistä knockdownia vasten (taulukko 3, sarakkeet 6-9 ja kuva 4). Kullekin algoritmikuviolle piirrettiin parhaan sovituksen mukainen viiva ja laskettiin R2-arvo osoituksena siitä, voidaanko algoritmin pisteytyksellä selittää knockdown-tehokkuuden vaihtelu. Tulokset vahvistavat, että shRNA:n tehon ja 5′ ΔΔG (vapaaenergiaeron) tarkastelujen tai Reynoldsin ym. algoritmin välinen yhteys on heikko, ja ne osoittavat myös heikon yhteyden Hsiehin ym. algoritmiin, ja kumpikin osoittaa itse asiassa heikkoa käänteistä korrelaatiota tietojen kanssa. Amarguizouin ja muiden, Ui-Tein ja muiden sekä Takasakin ja muiden algoritmit korreloivat suoraan shRNA:n tehokkuuden kanssa. Yksikään algoritmin pisteet eivät kuitenkaan selitä merkittävää prosenttiosuutta knockdown-tehokkuuden vaihtelusta. Testatuista algoritmeista Takasakin ym. pisteytysjärjestelmä osoittaa suurinta assosiaatiota, ja sen R2-arvo on 0,0251.

Koska nämä tulokset viittaavat siihen, että lineaarinen suhde ei päde vahvasti shRNA:n knockdowniin minkään kuuden algoritmin kohdalla, arvioimme kutakin algoritmia ROC-käyräanalyysin avulla määrittääksemme, onko jokin algoritmi ylivoimainen muita tehokkaiden shRNA:iden tunnistamisessa. ROC-käyrä on herkkyyden (todellisen positiivisen osuuden, TPF) ja spesifisyyden (väärän positiivisen osuuden, FPF) välinen kuvaaja, joka on luotu vaihtelemalla päätöksentekokynnystä algoritmin minimi- ja maksimipistemäärän välillä. ROC-käyrän diagonaali edustaa ROC-käyrää algoritmille, joka ei ole parempi erottelussa kuin satunnaisvalinta. Huonosti erottelevien algoritmien ROC-käyrät kulkevat diagonaalin suuntaisesti, ja niiden ROC-käyrän alapuolinen pinta-ala (AUC) ei poikkea merkittävästi diagonaalin AUC-arvosta (0,5). Algoritmeilla, jotka ovat hyviä erottelijoita, on ROC-käyrät, joiden ROC-käyrät poikkeavat voimakkaasti kuperasti diagonaalista ja AUC-arvot lähestyvät 1:tä ja eroavat merkittävästi diagonaalin AUC-arvosta.

Hsiehin ym. algoritmilla oli kovera ROC-käyrä (kuva 5A), mikä osoittaa, että herkkyys ja spesifisyys eivät ole hyväksyttäviä tehokkaiden shRNA:iden erottamisessa tehottomista. Kaikkien muiden algoritmien ROC-käyrät (kuvat 5B-F) seurasivat lähellä ROC-kaavion lävistäjää, ja niiden AUC-arvot eivät eronneet merkittävästi lävistäjän AUC-arvosta (kuvat 5B-F). Näin ollen mikään algoritmeista ei osoittanut tilastollisesti merkitsevää kykyä erottaa tehokkaat ja tehottomat shRNA:t toisistaan.

Takasakin ym. algoritmi (kuva 5F) osoitti lupaavimmalta tehokkaiden shRNA:iden erottelukyvyltään tehottomista. Tämä algoritmi kärsi kuitenkin suhteellisen suuresta väärien positiivisten tulosten osuudesta maksimipistemäärän lähellä olevilla päätöksentekokynnyksillä, kuten ROC-käyrän alkupisteen läheisyydessä oleva heikko, epäsäännöllinen poikkeama diagonaalista osoittaa (kuva 5F). Tämä osoitti, että algoritmi antoi korkean pistemäärän useille tehottomille shRNA:ille. Tietojen tarkastelu paljasti, että kaksi kolmesta korkean pistemäärän saaneesta tehottomasta shRNA:sta kohdistui geeneihin, joiden ilmentymistä onnistuttiin tyrmäämään muilla shRNA:illa (taulukko 3, tähdet). Näin ollen on epätodennäköistä, että shRNA:iden tehottomuus olisi seurausta geeniekspression vakaata tukahduttamista vastaan kohdistuvasta valikoivasta paineesta. On todennäköisempää, että Takasakin ym. algoritmi ei ota huomioon tehokkaiden shRNA:iden kriittistä ominaisuutta.

Kunkin shRNA:n kuuden keskeisen emäksen stabiilisuuteen perustuvan algoritmimuutoksen soveltaminen

Korkean pistemäärän saaneiden tehottomien shRNA:iden fysikaalisten ominaisuuksien tarkastelu paljasti, että shRNA:iden kuuden keskeisen emäksen muodostaman dupleksin (sense-juosteen emäkset 6-11 hybridisoituneena antisense-juosteen emästen 9-14 kanssa) keskiverto stabiilisuus oli suurempaa kuin korkean pistemäärän saaneiden tehokkaiden shRNA:iden keskiverto stabiilisuus (ΔG = -13.1 ± 0,1 vs. -11,1 ± 1 kcal/mol). Tämän havainnon perusteella Takasakin ym. algoritmia muutettiin siten, että shRNA:ille, joiden keskeisen dupleksin ΔG oli yhtä suuri tai pienempi kuin -12,9 kcal/mol, annettiin vähimmäispistemäärä (taulukko 4). Tällä muutoksella minimipisteet annettiin viidelle shRNA:lle, joista neljä oli tehottomia, mikä lisäsi algoritmin spesifisyyttä ilman merkittävää herkkyyden heikkenemistä. Yhdelle tehokkaalle shRNA:lle (71 % knockdown) annettu vähimmäispistemäärä osoittaa, että tehokkuuteen vaikuttavat muutkin ominaisuudet kuin keskeisen dupleksin stabiilisuus. Tämän muutoksen lisääminen poisti kuitenkin ROC-käyrän heikon epätasaisen poikkeaman diagonaalista korkeilla päätöksentekokynnyksillä ja nosti AUC-arvon 0,79:ään (kuva 5I). Myös Amarzguioui ym. ja Ui-Tei ym. algoritmien vastaavat muutokset nostivat niiden ROC-käyrien AUC-arvoja (kuvat 5G ja 5H). Tällä muutoksella kaikkien kolmen muutetun algoritmin ROC-käyrien AUC-arvot erosivat merkittävästi diagonaalin AUC-arvosta (kuvat 5G-I), mikä osoittaa tilastollisesti merkittävää ennustuskykyä. Muutettujen algoritmien ROC-käyrien AUC-arvojen väliset erot eivät olleet merkitseviä, joten tilastollisin perustein kaikki kolme muutettua algoritmia olivat yhtä käyttökelpoisia. 5′ ΔΔG-, Reynolds et al. ja Hsieh et al. -algoritmeja ei parannettu tilastollisesti merkitsevään ennustuskykyyn soveltamalla keskeisen dupleksin ΔG-muutosta (tietoja ei ole esitetty).

Tarkistaaksemme sen mahdollisuuden, että Amarzguioui ym., Ui-Tei ym. ja Takasaki ym. algoritmien muutoksella saavutettu parannus on seurausta siitä, että shRNA-joukkomme on sovitettu liikaa shRNA:iden joukolle, analyysin kohteena oli aiemmista julkaisuista koottu itsenäinen 38 shRNA:ta sisältävä joukko (; taulukko 5). Vaikka yhdenkään kolmen muuttamattoman algoritmin ROC-käyrän AUC-arvo ei eronnut merkittävästi diagonaalin AUC-arvosta (Amarzguioui ym., p = 0,174; Ui-Tei ym. p = 0,09; Takasaki ym., p = 0,26), kaikkien muunnettujen algoritmien ROC-käyrät poikkesivat merkittävästi diagonaalin AUC-arvosta (p = 0,0001-0,009; kuvat 5J-L). Tilastollisin perustein kaikki kolme muunnettua algoritmia olivat yhtä käyttökelpoisia, sillä muunnettujen algoritmien ROC-käyrien AUC-arvot poikkesivat kaikki merkitsevästi diagonaalin AUC-arvosta, mutta eivät eronneet merkitsevästi toisistaan. Tämä riippumattoman shRNA-joukon analyysi viittaa siihen, että algoritmien modifiointi on yleisesti käyttökelpoinen.

Koska väärän positiivisen tuloksen osuuden minimoiminen on ensisijainen huolenaihe shRNA-suunnittelussa, suosittelemme käyttämään modifioituja algoritmeja, joita ovat muokanneet Ui-Tei ym. algoritmia, jolla oli pienin suuri väärien positiivisten tulosten osuus päätöksentekokynnyksillä, jotka olivat lähellä maksimipistemäärää, kuten ROC-käyrän alkupisteen lähellä oleva voimakas poikkeama diagonaalista osoittaa (kuvat 5H ja 5K). Päätöksentekokynnyksen 3 käyttäminen rajoittaa shRNA:iden valinnan ROC-käyrän alueelle, jossa herkkyys oli hyväksyttävä (0,28-,33), kun taas spesifisyys oli erittäin hyvä (1,0). Asettamalla tämä päätöksentekokynnys väärien positiivisten osuudet minimoitiin, kun taas 28-33 % tehokkaista shRNA:ista tunnistettiin meidän shRNA:istamme ja vastaavasti julkaistusta shRNA-joukosta. Jos herkkyyttä on lisättävä, suosittelemme käyttämään päätöskynnystä 2. Tämän kynnyksen herkkyys oli 0,54 – 0,55 ja spesifisyys 0,88 – 0,9. Jos päätöksentekokynnystä lievennettiin edelleen 0:aan, herkkyys kasvoi 0,86-0,9:ään, mutta spesifisyys laski 0,55-0,54:ään. Suosittelemme korkeimman mahdollisen päätöksentekokynnyksen käyttämistä.

Vaikka tämä tutkimus on tilastollisesti pieni, sen etuna on tietojemme mukaan se, että se on tähän mennessä suurin julkaistu 19-meriin perustuvien shRNA:iden joukko. Lisäksi toisin kuin muissa shRNA-tutkimuksissa, jotka ovat väistämättä vinoutuneet kohti tehokkaita shRNA:ita, tutkimuksemme sisältää sekä toimivia että ei-toimivia shRNA:ita. Olemme osoittaneet, että modifioidut Ui-Tei ym., Amarzguioui ym. ja Takasaki ym. algoritmit ovat kohtuullisia tai hyviä ennustusvälineitä, jotka erottavat tehokkaat ja tehottomat shRNA:t toisistaan. Muutetuissa algoritmeissa on kuitenkin edelleen merkittäviä puutteita. Algoritmimuutosten suora arviointi kunkin alkuperäisen ja muutetun algoritmin mukaisesti suunniteltujen shRNA:iden avulla antaisi tukea näille havainnoille. Näiden algoritmien tarkoituksena on vähentää valittujen väärien positiivisten shRNA:iden määrää, ei poistaa niitä kokonaan, ja näin ollen tämä edellyttäisi suurta määrää shRNA:ita, jotta väärien positiivisten määrissä saataisiin tilastollisesti merkittävä ero. Suurempien shRNA-tietoaineistojen saatavuuden pitäisi tukea sellaisten algoritmien kehittämistä, joilla on parempi herkkyys ja spesifisyys. Lisäksi useista siRNA-oligonukleotidien suunnitteluun tarkoitetuista ohjelmistosovelluksista, joita ei otettu huomioon tässä tutkimuksessa, voi olla hyötyä shRNA:iden suunnittelussa. Toimivien siRNA-oligonukleotidien suunnittelun kriteerit ovat edelleen kiistanalaisia, mistä on osoituksena siRNA-suunnittelua koskevien tutkimusten suuri määrä, ja koska emme testanneet näitä sekvenssejä siRNA:na, ei voida todeta, soveltuuko näiden algoritmien muutos myös siRNA-oligonukleotidien yhteydessä. shRNA:lla on lisäkompleksisuutta siRNA-oligonukleotideihin nähden, sillä hiusneula on prosessoitava solun sisällä, ennen kuin se pääsee RISC-kompleksiin. Lisäksi valikoivan paineen sellaisten shRNA:iden vakaata ilmentymistä vastaan, jotka ovat haitallisia solun kasvulle, odotetaan antavan lisärajoituksen tiettyjen shRNA:iden vakaalle ilmentymiselle. Näistä monimutkaisuuksista huolimatta havaintomme alkavat tuoda tietoa siitä, miten siRNA-algoritmeja voidaan soveltaa toiminnallisten shRNA:iden suunnitteluun.