Design and preparation of shRNA plasmids

Azzal a kérdéssel kapcsolatban, hogy a shRNS-szekvencia hogyan korrelál a kiütés hatékonyságával, 27 shRNS-vektort terveztünk és építettünk 11 különböző génből (1. táblázat). A célszekvenciákat az egyes gének kódoló régiójában választottuk ki, és úgy terveztük, hogy nagyjából megfeleljenek a siRNS-oligomer hatékonyságára vonatkozó szekvenciajellemzőkkel kapcsolatos szemináriumi vizsgálatoknak . Ennek megfelelően a szekvenciák alacsony lefutásúak és körülbelül 50%-os G/C arányúak. A shRNS-eket olyan célhelyekre terveztük, amelyek mentesek az egynukleotid-polimorfizmusoktól, és megfelelnek a valós idejű PCR-primer-készleteink által amplifikált összes splice-változatnak.

Mivel az siRNS-eknek lehetnek off-target hatásai, a funkcionális vizsgálatokhoz fontos, hogy kontrollként egy vagy több bázis-eltérést tartalmazó specifikus mutánst készítsünk a célfelismerő helyen belül . Az idő- és költségtakarékosság érdekében kifejlesztettünk egy olyan módszert, amellyel egyszerre lehet vad típusú és mutáns shRNS-vektorokat készíteni (részletesen a Módszerek és az 1. ábra tartalmazza). Négy vad típusú/mutáns shRNS-pár génkiütési eredményei a 2. ábrán láthatók. Ezek az eredmények bizonyítják a módszer hasznosságát egy olyan pontmutáns shRNS-vektor előállításában, amely a vad típusú shRNS-ekkel történő génkiütés funkcióvesztéses kontrolljaként szolgálhat. Bár részletes protokollokat már publikáltak a shRNS-vektorok előállítására , ez az első protokoll a vad típusú és mutáns vektorok egyidejű előállítására, és megkönnyítheti a shRNS-ek nagymértékben ellenőrzött rendszerének megvalósítását.

Stratégia a hajszálszerkezeteken keresztül történő pontos szekvenáláshoz

A shRNS hajszálszerkezetek szekvenciájának ellenőrzése alapvető fontosságú, mivel a célszekvencián belül akár egyetlen nukleotid eltérése is megszüntetheti a knockdownt (2. ábra és .) A shRNS-vektorok előállítása során gyakran felmerülő probléma, hogy a hajtű belső másodlagos szerkezete miatt sok esetben nehéz a szekvenálás. Az egyik nemrégiben javasolt stratégia e probléma megoldására magában foglalja egy restrikciós hely kialakítását a hajtű hurok/törzs régiójában, hogy emésztéssel fizikailag elválassza az invertált ismétlődéseket, majd a szekvencia összeillesztését sense és antisense primerekkel . Egyértelmű előnyt jelentene azonban, ha a shRNS-konstrukciók szekvenálását a szár/hurok szekvencia módosítása nélkül lehetne megvalósítani. Ennek a lehetőségnek a vizsgálatára módosított szekvenálási reakciókat értékeltünk a hajtű másodlagos szerkezetének átolvasásának javítása érdekében három shRNA hajtűben. A módosítások közé tartozik a DNS-szerkezet lazítására ismert szerek, köztük DMSO, betain, PCRx Enhancer és ThermoFidelase I hozzáadása; valamint növekvő mennyiségű dGTP BigDye terminátor (dGTP) kémiai anyag hozzáadása a standard BigDye v1.1 (BD) kémiai anyaghoz, amely dGTP helyett dITP-t tartalmaz.

A szekvenálási eredményeket a három DNS-konstrukció mindegyikére vonatkozóan a 2. táblázat foglalja össze. A hajtűszerkezet átolvasását a hajtűszerkezet utáni kb. 300 bázist követő csúcsmagasság és a hajtűszerkezet előtti kb. 50 bázist megelőző jel arányaként mértük. Az 1-es arány azt jelzi, hogy a jel nem veszít, a 0 pedig az átolvasás teljes elvesztését. A BD-kémia bármilyen adalékanyagának hiányában a hajtű a kevésbé szorosan strukturált hajtű, a pHSPG-shmutTLR4 esetében a csúcsmagasság arányának 0,4-re való csökkenését, a másik két plazmid esetében pedig az átolvasás teljes elvesztését okozta. Ez a pHSPG-shTLR4 szekvencia-csúcsprofiljának hirtelen leállásaként látható (3A. ábra).

A DNS-relaxáló szerek közül az 5% DMSO, a 0,83 M betain és az 1 × PCRx Enhancer mindegyike jelentősen javította a szekvenciaolvasást néhány konstrukció esetében. A 0,83 M betain plusz 1 × PCRx Enhancer hozzáadása a BD kémiához azonban a legkövetkezetesebben szekvenált, a csúcsmagasságok aránya 0,5-0,9 volt (2. táblázat és 3B. ábra). A 10:1 BD:dGTP vegyületek hozzáadása önmagában szintén javította valamelyest az átolvasást, a csúcsmagasságok aránya 0,5-0,6 volt (2. táblázat és 3C. ábra). A 10:1 BD:dGTP esetében a nem optimális csúcsmagassági arány annak tulajdonítható, hogy a szekvenciacsúcs profiljában a szekunderszerkezeti régió után látható egy lépcsőfok, ahol a jel csökken (3C. ábra, nyíl). A dGTP-kémia tartalmának 5:1 és 3:1 BD:dGTP arányra való növelése vagy az egyenes dGTP-kémia alkalmazása növelte a csúcsmagasság arányát és némileg csökkentette a lépcsőfokot (0,6-0,8 arány). A dITP és dGTP vegyes beépítése azonban rosszabb csúcsszélesedést eredményezett, ahogy a felhasznált dGTP mennyisége nőtt , és a csak dGTP kémia súlyos szekvencia-összenyomódásokat okozott (az adatok nem láthatóak). A legjobb általános eredményeket a betain plusz PCRx és a 10:1 BD:dGTP vegyes kémiai eljárások együttes kombinálásával értük el. Ez a kombináció csökkentette a lépést kevesebb csúcsszélesedéssel és növelte a csúcsmagassági arányokat 0,9-1,0-ra (2. táblázat és 3D ábra). A ThermoFidelase I, egy DNS destabilizáló enzim, amelyet gyakran használnak a genomi DNS szekvenálásának javítására , nem javította a három hajtű szekvenálását az egyenes BD-kémia egyikénél sem (az adatok nem láthatóak), és valójában jelentősen csökkentette a csúcsmagasság arányát a 10:1 BD:dGTP vegyületeknél mindhárom shRNS-konstrukció esetében, ami a hajtűszerkezetnél a stop újbóli megjelenését okozta (2. táblázat és 3E. ábra).

Összefoglalva, a 10:1 BD:GTP vegyületek, a 0,83 M betain és az 1 × PCRx Enhancer kombinációja optimális szekvenálást biztosított, a vegyes BD:dGTP vegyületek, a betain, a PCRx Enhancer és a DMSO pedig önmagukban is rendelkeztek némi pozitív hatással. A ThermoFidelase I-t azonban valószínűleg kerülni kell a nehéz belső szekunder szerkezetű shRNS-vektorok esetében.

Korreláció a shRNS knockdown hatékonysága és az siRNS-tervezésre vonatkozó közzétett algoritmusok között

Hogy meghatározzuk, hogy a shRNS-vektorok által végzett knockdown hatékonysága korrelál-e a hatékony siRNS oligonukleotidok tervezésére vonatkozó közzétett szabályokkal, a shRNS-eket a génexpresszió knockdown képességük szempontjából értékeltük. A shRNS-eket stabilan transzdukáltuk a THP1 vagy a Jurkat humán sejtvonalakba a 3. táblázat első két oszlopában részletezettek szerint. Az átlagos kopogáscsökkentést három vagy több különböző napon gyűjtött RNS-ből határoztuk meg, és minden egyes shRNS esetében fel van tüntetve (3. oszlop). A knockdown reprodukálhatónak bizonyult az egymástól függetlenül transzdukált és szortírozott sejtvonalak esetében, ami arra utal, hogy a knockdown inkább a shRNS célszekvencia függvénye, mint a vírusos transzdukció jellemzői. A konstruált shRNS-vektorok több mint egyharmada nem volt képes elnyomni a transzkripciót (<10% a 3. oszlopban), annak ellenére, hogy ezekben a sejtvonalakban hasonló növekedési ráták és a GFP marker hosszú távú, magas szintű expressziója volt tapasztalható. Továbbá, a számos azonos gén ellen készített shRNS-ek (pl. CLR16.2, CLR19.3 és TLR4) kopogtatási hatékonyságának nagyfokú eltérései ellene szólnak az e gének hatékonyságában mutatkozó különbségek egyszerű biológiai okainak. Számos hatástalan shRNS negatív 5′ ΔΔG értékkel és magas Reynolds pontszámmal rendelkezik, amelyekről feltételezték, hogy korrelálnak a siRNS knockdown hatékonyságával (3. táblázat, 4. és 5. oszlop) . Ezzel szemben azon shRNS-ek közül, amelyek képesek voltak génkiütést okozni, többnek pozitív 5’ΔΔG-értéke vagy alacsony Reynolds-pontszáma volt. Ezek az eredmények azt jelzik, hogy az 5’ΔΔG és a Reynolds pontozási algoritmus az siRNS-ek esetében nem biztos, hogy pozitív korrelatív kritériumokat biztosít a shRNS-tervezéshez.

Hogy meghatározzuk, hogy az siRNS oligonukleotidok tervezéséhez használt egyéb közzétett algoritmusok alkalmazhatók-e shRNS-vektorokra, minden shRNS-célhelyet négy további algoritmussal értékeltünk, és a pontszámokat az egyes shRNS-ek százalékos knockdownjával ábrázoltuk (3. táblázat, 6-9. oszlop és 4. ábra). Minden algoritmus ábrázolásához megrajzoltuk a legjobb illeszkedési egyenest, és kiszámítottuk az R2 értéket annak jelzésére, hogy a kiütés hatékonyságának szórása megmagyarázható-e az algoritmus pontszámításával. Az eredmények megerősítik, hogy a shRNS hatékonysága és az 5′ ΔΔG (szabad energia differenciál) megfontolások vagy a Reynolds et al. algoritmus között gyenge kapcsolat áll fenn, és a Hsieh et al. algoritmussal is gyenge kapcsolatot mutatnak, és mindegyik gyenge fordított korrelációt mutat az adatokkal. Az Amarguizoui et al. , Ui-Tei et al. és Takasaki et al. algoritmusai közvetlenül korrelálnak a shRNS hatékonyságával. Azonban egyik algoritmus pontszáma sem magyarázza a knockdown hatékonyság varianciájának jelentős százalékát. A vizsgált algoritmusok közül a Takasaki et al. pontozási rendszere mutatja a legnagyobb összefüggést, az R2-érték 0,0251.

Mivel ezek az eredmények arra utalnak, hogy a lineáris összefüggés a shRNS knockdownra nem érvényesül erősen a hat algoritmus egyikére sem, az egyes algoritmusokat ROC-görbeelemzéssel értékeltük, hogy meghatározzuk, hogy bármelyik algoritmus jobb-e a többinél a hatékony shRNS-ek azonosításában. A ROC-görbe az érzékenység (a valódi pozitív frakció, TPF) és az 1 mínusz a specificitás (a hamis pozitív frakció, FPF) diagramja, amelyet a döntési küszöbértéknek az algoritmus minimális és maximális pontszáma közötti változtatásával hozunk létre. A ROC-diagram átlója egy olyan algoritmus ROC-görbéjét mutatja, amely nem jobb a megkülönböztetésben, mint a véletlenszerű kiválasztás. A rosszul diszkrimináló algoritmusok ROC-görbéje az átló mentén halad, és a ROC-görbe alatti terület (AUC) nem különbözik jelentősen az átló AUC-jától (0,5). A jól diszkrimináló algoritmusok ROC-görbéi erősen konvexen térnek el az átlótól, és az AUC-értékek megközelítik az 1-et, és jelentősen eltérnek az átló AUC-értékétől.

A Hsieh és munkatársai algoritmusa konkáv ROC-görbével rendelkezett (5A. ábra), ami elfogadhatatlan érzékenységet és specificitást jelez a hatékony és hatástalan shRNS-ek megkülönböztetésében. Az összes többi algoritmus ROC-görbéje (5B-F. ábra) a ROC-diagonális közelében követte a ROC-diagramot, és az AUC-értékek nem különböztek jelentősen az AUC-értéktől (5B-F. ábra). Így egyik algoritmus sem mutatott statisztikailag szignifikáns képességet a hatékony és hatástalan shRNS-ek megkülönböztetésére.

A Takasaki et al. algoritmus (5F ábra) mutatta a legígéretesebbnek a hatékony és hatástalan shRNS-ek megkülönböztetését. Ez az algoritmus azonban a maximális pontszámhoz közeli döntési küszöbértékek esetében viszonylag magas hamis pozitív frakciótól szenvedett, amit a ROC-görbe origójának közelében az átlótól való gyenge, szabálytalan eltérés jelez (5F. ábra). Ez azt jelezte, hogy az algoritmus számos hatástalan shRNS-hez magas pontszámot rendelt. Az adatok vizsgálata feltárta, hogy a három magas pontszámú hatástalan shRNS közül kettő olyan géneket célzott meg, amelyek expresszióját más shRNS-ek sikeresen leverték (3. táblázat, csillagok). Így nem valószínű, hogy a shRNS-ek hatástalansága a génexpresszió stabil elnyomása elleni szelekciós nyomás következménye. Sokkal valószínűbb, hogy a Takasaki és munkatársai algoritmusa nem veszi figyelembe a hatékony shRNS-ek egy kritikus jellemzőjét.

Az egyes shRNS-ek 6 központi bázisának stabilitásán alapuló algoritmus-módosítás alkalmazása

A magas pontszámú hatástalan shRNS-ek fizikai tulajdonságainak vizsgálata kimutatta, hogy a shRNS-ek 6 központi bázisa által alkotott duplex (a sense szál 6-11 bázisa hibridizálódott az antisense szál 9-14 bázisával) átlagos stabilitása nagyobb volt, mint a magas pontszámú hatékony shRNS-ek átlagos stabilitása (ΔG = -13.1 ± 0,1 versus -11,1 ± 1 kcal/mol). E megfigyelés alapján a Takasaki et al. algoritmust úgy módosították, hogy a -12,9 kcal/mol vagy annál kisebb központi duplex ΔG-vel rendelkező shRNS-ek minimális pontszámot kaptak (4. táblázat). Ez a módosítás öt shRNS-hez rendelt minimális pontszámot, amelyek közül négy hatástalan volt, így növelve az algoritmus specificitását az érzékenység jelentős csökkenése nélkül. Az egy hatékony shRNS-hez (71%-os knockdown) rendelt minimális pontszám azt jelzi, hogy a központi duplex stabilitásán kívül más tulajdonságok is befolyásolják a hatékonyságot. Mindazonáltal e módosítás hozzáadása megszüntette a ROC-görbének az átlótól való gyenge szabálytalan eltérését magas döntési küszöbértékek esetén, és 0,79-re növelte az AUC-t (5I. ábra). Az Amarzguioui et al. és az Ui-Tei et al. algoritmusok hasonló módosítása szintén megemelte a ROC-görbéik AUC-értékét (5G. és 5H. ábra). Ezzel a módosítással mindhárom módosított algoritmus ROC-görbéjének AUC értékei szignifikánsan eltértek az átlós AUC értékétől (5G-I. ábra), ami statisztikailag szignifikáns előrejelző képességet jelez. A módosított algoritmusok ROC-görbéinek AUC-értékei közötti különbségek nem voltak szignifikánsak, így statisztikai alapon mindhárom módosított algoritmus azonos hasznosságú volt. Az 5′ ΔΔG, a Reynolds et al. és a Hsieh et al. algoritmusok nem javultak statisztikailag szignifikáns előrejelző képességre a központi duplex ΔG módosítás alkalmazásával (az adatok nem láthatóak).

Az Amarzguioui et al., Ui-Tei et al. és Takasaki et al. algoritmusok módosításával elért javulás annak a lehetőségnek a vizsgálatára, hogy a mi shRNS-készletünk túlillesztésének következménye, egy 38 shRNS-ből álló, korábbi publikációkból összevont független shRNS-készletet (; 5. táblázat) vetettünk alá elemzésnek. Míg a három nem módosított algoritmus ROC-görbéi közül egyiknek sem volt az átlótól szignifikánsan eltérő AUC-ja (Amarzguioui et al., p = 0,174; Ui-Tei et al. p = 0,09; Takasaki et al., p = 0,26), a módosított algoritmusok mindegyike olyan ROC-görbéket eredményezett, amelyek AUC-ja szignifikánsan különbözött az átló AUC-jától (p = 0,0001-0,009; 5J-L. ábra). Statisztikai szempontból mindhárom módosított algoritmus azonos hasznosságú volt, mivel a módosított algoritmusok ROC-görbéinek AUC értékei mind szignifikánsan különböztek az átlós AUC értékétől, de nem különböztek szignifikánsan egymástól. A shRNS-ek független halmazának ilyen elemzése arra utal, hogy az algoritmusok módosítása általános érvényességgel bír.

Mivel a hamis pozitív arány minimalizálása az elsődleges szempont a shRNS-tervezés során, javasoljuk a módosított Ui-Tei et al. algoritmust, amely a maximális pontszámhoz közeli döntési küszöbértékeknél mutatta a legalacsonyabb magas hamis pozitív frakciót, amit a ROC-görbe origójának közelében az átlótól való erős eltérés jelez (5H és 5K ábra). A 3-as döntési küszöbérték használata a shRNS-ek kiválasztását a ROC-görbe olyan régiójára korlátozza, ahol az érzékenység elfogadható (0,28-,33), míg a specificitás nagyon jó (1,0) volt. E döntési küszöbérték beállításával minimalizáltuk a hamis pozitív frakciót, miközben a hatékony shRNS-ek 28-33%-át azonosítottuk a mi shRNS-ünkből, illetve a közzétett shRNS-készletből. Amennyiben az érzékenységet növelni kell, javasoljuk a 2-es döntési küszöbérték használatát. Ezzel a küszöbbel az érzékenység 0,54 – 0,55, a specificitás pedig 0,88 – 0,9 volt. Ha a döntési küszöböt tovább lazítjuk 0-ra, az érzékenység 0,86-0,9-re nő, de a specificitás 0,55-0,54-re csökken. Javasoljuk, hogy e döntési küszöbértékek közül a lehető legmagasabbat használjuk.

Noha statisztikailag kicsi, ennek a vizsgálatnak az az előnye, hogy tudomásunk szerint ez a 19-mer alapú shRNS-ek eddigi legnagyobb publikált készlete. Ezenkívül más shRNS-vizsgálatokkal ellentétben, amelyek szükségszerűen a hatékony shRNS-ek felé torzítanak, a mi vizsgálatunk funkcionális és nem funkcionális shRNS-eket egyaránt tartalmaz. Megmutattuk, hogy a módosított Ui-Tei et al., Amarzguioui et al. és Takasaki et al. algoritmusok tisztességes vagy jó előrejelző eszközök, amelyek megkülönböztetik a hatékony és a nem hatékony shRNS-eket. A módosított algoritmusokban azonban még mindig jelentős hiányosságok vannak. Az algoritmus-módosítások közvetlen értékelése az egyes eredeti és módosított algoritmusok szerint tervezett shRNS-ek felhasználásával alátámasztaná ezeket a megállapításokat. Ezen algoritmusok célja a kiválasztott hamis pozitív shRNS-ek számának csökkentése, nem pedig azok teljes kiküszöbölése, és így ehhez nagy számú shRNS-re lenne szükség ahhoz, hogy statisztikailag szignifikáns különbséget érjünk el a hamis pozitív arányban. A nagyobb shRNS-adatkészletek rendelkezésre állása támogatni fogja a jobb érzékenységű és specifitású algoritmusok kifejlesztését. Ezenkívül számos olyan siRNS oligonukleotid-tervezésre szolgáló szoftveralkalmazás, amelyet ebben a vizsgálatban nem vettünk figyelembe, hasznos lehet a shRNS-ek tervezésében . A funkcionális siRNS oligonukleotidok tervezésének kritériumai továbbra is ellentmondásosak, amint azt az siRNS-tervezésre még mindig kidolgozott tanulmányok nagy száma bizonyítja, és mivel ezeket a szekvenciákat nem siRNS-ként teszteltük, nem lehet megállapítani, hogy ezen algoritmusok módosítása az siRNS oligonukleotidokkal összefüggésben is alkalmazható-e. A shRNS a siRNS oligonukleotidokhoz képest további komplexitással rendelkezik, mivel a hajtűt a sejtben kell feldolgozni, mielőtt belép a RISC-komplexbe. Ezenkívül a sejtnövekedést károsító shRNS-ek stabil kifejeződése elleni szelekciós nyomás várhatóan további korlátot jelent bizonyos shRNS-ek stabil kifejeződéséhez. E komplexitások ellenére eredményeink kezdenek betekintést nyújtani a siRNS-algoritmusok funkcionális shRNS-ek tervezéséhez való alkalmazhatóságába.