InmunohistoquímicaEditar
La inmunohistoquímica o tinción IHC de secciones de tejido (o inmunocitoquímica, que es la tinción de células), es quizás la técnica de inmunotinción más comúnmente aplicada. Si bien los primeros casos de tinción IHC utilizaban tintes fluorescentes (véase inmunofluorescencia), en la actualidad se utilizan otros métodos no fluorescentes que emplean enzimas como la peroxidasa (véase tinción con inmunoperoxidasa) y la fosfatasa alcalina. Estas enzimas son capaces de catalizar reacciones que dan lugar a un producto coloreado fácilmente detectable por microscopía óptica. Alternativamente, pueden utilizarse elementos radiactivos como etiquetas, y la inmunorreacción puede visualizarse mediante autorradiografía.
La preparación o fijación del tejido es esencial para la conservación de la morfología celular y la arquitectura del tejido. Una fijación inadecuada o prolongada puede disminuir significativamente la capacidad de unión de los anticuerpos. Muchos antígenos pueden demostrarse con éxito en secciones de tejido fijadas con formalina e incluidas en parafina. Sin embargo, algunos antígenos no sobreviven incluso a cantidades moderadas de fijación con aldehídos. En estas condiciones, los tejidos deben congelarse rápidamente en nitrógeno líquido y cortarse con un criostato. Las desventajas de las secciones congeladas incluyen una morfología deficiente, una resolución deficiente a grandes aumentos, la dificultad de cortar sobre secciones de parafina y la necesidad de almacenamiento congelado. Por otro lado, las secciones con vibratomo no requieren que el tejido se procese con disolventes orgánicos o con calor elevado, lo que puede destruir la antigenicidad, ni que se altere con la descongelación por congelación. La desventaja de las secciones con vibratomo es que el proceso de seccionamiento es lento y difícil con tejidos blandos y mal fijados, y que las marcas de vibración o las líneas del vibratomo son a menudo evidentes en las secciones.
La detección de muchos antígenos puede mejorarse drásticamente mediante métodos de recuperación de antígenos que actúan rompiendo algunos de los enlaces cruzados de proteínas formados por la fijación para descubrir sitios antigénicos ocultos. Esto puede lograrse calentando durante periodos de tiempo variables (recuperación de epítopos inducida por calor o HIER) o utilizando la digestión enzimática (recuperación de epítopos inducida por proteólisis o PIER).
Una de las principales dificultades de la tinción IHC es superar el fondo específico o no específico. La optimización de los métodos y tiempos de fijación, el pretratamiento con agentes de bloqueo, la incubación de anticuerpos con alta sal, y la optimización de los tampones de lavado posteriores a los anticuerpos y los tiempos de lavado son importantes para obtener una inmunotinción de alta calidad. Además, la presencia de controles positivos y negativos para la tinción es esencial para determinar la especificidad.
Citometría de flujoEditar
Un citómetro de flujo puede utilizarse para el análisis directo de células que expresan una o más proteínas específicas. Las células se inmunotinción en solución utilizando métodos similares a los utilizados para la inmunofluorescencia, y luego se analizan mediante citometría de flujo.
La citometría de flujo tiene varias ventajas sobre la IHC, entre ellas: la capacidad de definir poblaciones celulares distintas por su tamaño y granularidad; la capacidad de excluir las células muertas; la mejora de la sensibilidad; y el análisis multicolor para medir varios antígenos simultáneamente. Sin embargo, la citometría de flujo puede ser menos eficaz a la hora de detectar poblaciones celulares extremadamente raras, y hay una pérdida de relaciones arquitectónicas en ausencia de una sección de tejido. La citometría de flujo también tiene un alto coste de capital asociado a la compra de un citómetro de flujo.
Western blotEditar
El Western blot permite la detección de proteínas específicas a partir de extractos hechos de células o tejidos, antes o después de cualquier paso de purificación. Las proteínas se separan generalmente por tamaño mediante electroforesis en gel antes de ser transferidas a una membrana sintética mediante métodos de blotting seco, semiseco o húmedo. A continuación, la membrana puede sondearse con anticuerpos mediante métodos similares a los de la inmunohistoquímica, pero sin necesidad de fijación. La detección se realiza normalmente utilizando anticuerpos ligados a peroxidasa para catalizar una reacción quimioluminiscente.
El Western blotting es un método rutinario de biología molecular que puede utilizarse para comparar semicuantitativamente los niveles de proteínas entre extractos. La separación de tamaños previa al blotting permite calibrar el peso molecular de la proteína en comparación con marcadores de peso molecular conocidos.
Ensayo de inmunoabsorción ligado a enzimasEditar
El ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas o ELISA es un método de diagnóstico para determinar cuantitativa o semicuantitativamente las concentraciones de proteínas del plasma sanguíneo, el suero o los extractos de células/tejidos en un formato de placa de varios pocillos (normalmente 96 pocillos por placa). En términos generales, las proteínas en solución se adsorben a las placas ELISA. Se utilizan anticuerpos específicos para la proteína de interés para sondear la placa. El fondo se minimiza optimizando los métodos de bloqueo y lavado (como en el caso de la IHC), y la especificidad se garantiza mediante la presencia de controles positivos y negativos. Los métodos de detección suelen ser colorimétricos o basados en la quimioluminiscencia.
Microscopía inmunoelectrónicaEditar
La microscopía electrónica o ME puede utilizarse para estudiar la microarquitectura detallada de tejidos o células. La inmuno-EM permite la detección de proteínas específicas en secciones de tejido ultrafinas. Los anticuerpos marcados con partículas de metales pesados (por ejemplo, oro) pueden visualizarse directamente mediante microscopía electrónica de transmisión. Aunque es potente para detectar la localización subcelular de una proteína, la inmuno-EM puede ser técnicamente complicada y costosa, y requiere una optimización rigurosa de los métodos de fijación y procesamiento de los tejidos. La biotinilación de proteínas in vivo se propuso para aliviar los problemas causados por la frecuente incompatibilidad de la tinción de anticuerpos con los protocolos de fijación que preservan mejor la morfología celular.