Clostridium botulinum – Botulismo (Formas clínicas). Pruebas para el diagnóstico del botulismo. Detección de la toxina en pacientes, alimentos, piensos, lodos o sedimentos acuáticos; aves acuáticas, otras muestras. Pruebas recomendadas: detección de la toxina, cultivo de C. botulinum, tipificación de la toxina botulínica; diagnóstico molecular (PCR).

Características de Clostridium botulinum y de la/s toxina/s botulínica/s

Clostridium botulinum es un bacilo grampositivo anaerobio estricto, género Clostridium, familia Clostridiaceae, formador de esporas, que produce una toxina neurotóxica. Esta bacteria suele encontrarse en el suelo y en aguas dulces y sedimentos no tratados (océanos, lagos), con una distribución mundial. En algunas circunstancias este organismo puede contaminar los alimentos y crecer en ellos para producir su/s toxina/s. El botulismo, una forma grave de intoxicación alimentaria, resulta de la ingestión de alimentos que contienen la toxina. Aunque esta enfermedad es poco frecuente, su tasa de mortalidad es elevada. Cuando se determinó el tipo de toxina entre 1036 casos detectados en EE.UU. entre 1899 y 1990, 384 fueron por la toxina A, 106 por la toxina B, 105 por la toxina E y 3 por la toxina F. A veces puede haber casos debidos a dos toxinas, por ejemplo la A y la B.

Todas las formas de botulismo humano o animal, son causadas por la absorción de la toxina botulínica formada durante la multiplicación de la bacteria Clostridium botulinum. La toxina tiene una toxicidad (neurotoxicidad) muy elevada, por lo que ejerce su acción a niveles extremadamente bajos, es termolábil, mientras que las esporas de la bacteria son resistentes al calor y sobreviven en alimentos calentados a más de 100ºC, como los enlatados bajo tratamiento térmico. Además, algunas cepas de C. botulinum, C. butyricum, C. baratii y C. argentinense pueden producir neurotoxinas botulínicas.

Existen siete tipos de toxinas (A – G) diferenciables por pruebas de neutralización, útiles para la clínica y la epidemiología. Los tipos A, B, E y F son los principales causantes del botulismo humano, mientras que los tipos C y D se encuentran en casos de botulismo animal, siendo los más afectados las aves silvestres y de corral, el ganado vacuno, los caballos y algunas especies de peces. Los tipos A y B son los más comunes en el hombre, y están relacionados principalmente con la contaminación de verduras enlatadas preparadas en casa, pero en Europa también se han encontrado estos tipos en relación con productos cárnicos. El tipo E (pescado) se encuentra en entornos acuáticos y se correlaciona con los casos de botulismo E relacionados con pescado o marisco contaminado, y está aumentando. El tipo F es excepcional. El tipo C se subdivide en C1 (neurotoxina) y C2 (no neurotoxina, afecta a la permeabilidad vascular y es enterotoxigénico). El tipo G es producido por C. argentiniense (aislado del suelo en Argentina, suero de pacientes fallecidos, aunque no está clara su participación).

Las toxinas se sintetizan durante el crecimiento de la bacteria como una proteína inactiva (150 kDa), que se libera de la bacteria durante la lisis. Para activar la toxina formada debe degradarse en dos cadenas polipeptídicas (50 y 100 kDa).

C. botulinum, puede diferenciarse en grupos según sus características de cultivo, bioquímicas y fisiológicas. Todos los cultivos de tipo A y algunos de los de tipo B y F son proteolíticos. Los cultivos de toxinas de C. botulinum producidos por C y D no son proteolíticos, cuando se cultivan en un medio con clara de huevo coagulada o carne. Todos los tipos E y algunos de los tipos B y F son no proteolíticos, pero tienen características del metabolismo de los carbohidratos que difieren de los grupos no proteolíticos de los tipos C y D. Las cepas del tipo G no han sido estudiadas con suficiente detalle para una caracterización efectiva y satisfactoria.

La temperatura óptima para el crecimiento y la producción de toxinas es de unos 35ºC para las cepas proteolíticas; para las cepas no proteolíticas es de 26-28ºC. Las cepas no proteolíticas de los tipos B, E y F pueden producir toxina a temperaturas de refrigeración (3-4ºC). Las toxinas de las cepas no proteolíticas no muestran su máxima toxicidad hasta que se activa la toxina con tripsina. Las toxinas de las cepas proteolíticas se producen generalmente en su forma activada.

Formas clínicas de botulismo

Hay cuatro formas clínicas de botulismo humano:

• Intoxicación alimentaria (botulismo de origen alimentario), debida a la ingestión de alimentos contaminados con Clostridium botulinum en los que se forma la toxina.

• Botulismo de las heridas, producido por la infección de la herida con Clostridium botulinum y el desarrollo de la toxina in vivo tras el crecimiento de la bacteria en la herida.

• Botulismo infantil, producido por la producción de la toxina en el tracto digestivo de niños pequeños colonizados por Clostridium botulinum (la causa más común se debe a la ingestión de miel o jarabe de maíz contaminados), seguida de la absorción de la toxina. Estos pacientes pueden tener anticuerpos contra la toxina.

• Botulismo intestinal en adultos, causado por la colonización digestiva por Clostridium botulinum en los ancianos, seguida de la absorción de la toxina. Estos pacientes pueden tener anticuerpos contra la toxina.

En cualquiera de las formas clínicas de botulismo humano, e igual en el botulismo animal, la toxina penetra en la sangre desde el tracto gastrointestinal cuando se ingiere preformada con un alimento, o cuando es producida por la bacteria que coloniza el tracto digestivo (niños pequeños o adultos), o en casos excepcionales niños desde una herida infectada con la bacteria. Hay algunos alimentos que son más propensos que otros a contener la toxina botulínica. Los alimentos con un pH inferior a 4,5 son más difíciles de ser causa de botulismo ya que a este pH C. botulinum es incapaz de multiplicarse y producir toxina (es el caso de los zumos de frutas, los alimentos marinados con vinagre, etc.). Por el contrario, los alimentos con pH igual o superior a 4,5 pueden causar botulismo, ya que en ellos es posible la multiplicación y producción de toxina (es el caso de la carne, el pescado, las verduras, los platos preparados, etc.), en todos aquellos alimentos expuestos sin oxígeno, como ocurre con los alimentos enlatados o envasados al vacío, y que tienen un pH superior a 4,6. Son ejemplos de alimentos peligrosos: el jamón curado, los ahumados, las conservas de pescado o de verduras (sometidas a un tratamiento térmico insuficiente para matar las esporas), etc. Las latas contaminadas con C. botulinum suelen estar curvadas, aunque esto no ocurre con el tipo E.

La toxina absorbida se une irreversiblemente a las uniones neuromusculares de las neuronas motoras, impidiendo la liberación de acetilcolina y provocando parálisis flácida o debilidad muscular.

Clinicamente se caracteriza por una parálisis flácida aguda, que suele comenzar con una afectación bilateral de los nervios craneales, afectando a los músculos de la cara, la cabeza y la faringe, y luego desciende simétricamente hasta afectar a los músculos del tórax y las extremidades. La muerte, cuando se produce, se debe a una insuficiencia respiratoria por parálisis de la lengua y los músculos faríngeos que ocluyen la vía aérea superior, o por parálisis del diafragma y los músculos intercostales. Por este motivo, los pacientes deben recibir antitoxina botulínica y los cuidados intensivos respiratorios necesarios.

Pruebas de diagnóstico del botulismo

Detección de la toxina botulínica en muestras o alimentos sin cultivo (véase la muestra recomendada en la sección de pruebas “Pruebas ofrecidas por IVAMI y muestras necesarias”).

Se recomienda en un paciente con evidencia clínica de botulismo.

La detección de la toxina botulínica puede realizarse en un líquido como el suero obtenido de la sangre. También puede detectarse a partir de los restos de alimentos ingeridos que hayan provocado un caso o un brote de botulismo. Para realizar la prueba a partir de restos de alimentos es necesario obtener un extracto filtrado de los mismos. En los casos de botulismo infantil o botulismo intestinal se puede detectar la presencia de toxina en las heces de los niños o pacientes, pero se considera más recomendable realizar un cultivo previo de las heces (ver más adelante). La detección de la toxina del botulismo en cualquiera de los casos se realiza mediante la inoculación en ratones que desarrollan síntomas paralíticos, seguidos de muerte, si se les inocula la toxina botulínica. Para confirmar que los ratones han muerto a causa de la toxina botulínica inoculada, es necesaria una prueba de neutralización, que confirma que había toxina botulínica e identifica el tipo de toxina botulínica presente. Esta prueba de neutralización se realiza enfrentando el producto inoculado (suero de persona o animal, extracto de alimento ingerido, …) a antisueros específicos de cada tipo de toxina.

Antes del paso de la prueba de neutralización es necesario calcular la dosis letal mínima (DLM). Así calculamos la dilución máxima (más alta) que provoca la muerte de los animales infectados, y el volumen inoculado que ha provocado la muerte de los animales contiene una dosis mínima letal (DML).

Para identificar el tipo de toxina, una vez conocida la “Dosis Mínima Letal”, ésta se enfrenta con diferentes antisueros del tipo antitoxina botulínica. Estas mezclas se inocularán en igual volumen a los ratones de experimentación y a los que sobrevivan, se les habrá inoculado la mezcla de “dosis mínima letal” más el antisuero de un tipo que haya sido capaz de neutralizar.

Detección de la toxina en muestras/productos después del cultivo previo (ver Muestra recomendada después en la prueba ofrecida por IVAMI y muestras requeridas).

Cuando la bacteria Clostridium botulinum, que produce la toxina, puede encontrarse en la muestra se recomienda el cultivo previo, para investigar la toxina después de haber cultivado la muestra. Este es el caso de las heces de un paciente con botulismo infantil o botulismo intestinal, los restos de alimentos ingeridos en los que haya proliferado la bacteria (por ejemplo, conservas de lata), un alimento sospechoso que pueda contener la bacteria (por ejemplo, una conserva abombada), un alimento bajo control para excluir la presencia de esta bacteria (por ejemplo, embutidos, jamones, latas), u otras muestras como lodos de agua dulce o sedimentos marinos acuáticos, etc., procedentes de zonas en las que se ha observado mortalidad en aves acuáticas.

Durante el cultivo en el laboratorio, en medios de cultivo adecuados, se produce la toxina si hay una bacteria y la obtención de un filtrado de cultivo puede ser útil para investigar su presencia, inoculando el filtrado a ratones. Si los ratones inoculados se ven afectados indican la probable presencia de Clostridium botulinum en la muestra o el crecimiento en cultivo. Sin embargo, los ratones pueden haber muerto por otra causa, por lo que es necesario, antes de emitir el informe, comprobar que realmente han muerto por haber sido inoculados con toxina botulínica.

Para confirmar la presencia de toxina botulínica en el cultivo se pueden realizar pruebas de neutralización utilizando antisueros específicos para cada tipo de toxina botulínica (prueba de neutralización), o detección de la presencia de genes de Clostridium botulinum y de su tipo en el medio de cultivo (detección molecular por PCR).

La prueba de neutralización se realiza enfrentando la muestra inoculada (filtrado del cultivo) a antisueros específicos para cada tipo de toxina.

Antes del paso de la prueba de neutralización es necesario calcular la dosis mínima letal (MLD). Así se calcula la dilución máxima (más alta) que provoca la muerte de los animales inoculados, y el volumen inoculado que ha provocado la muerte de los animales contiene una dosis mínima letal.

Para identificar el tipo de toxina, una vez conocida la “dosis mínima letal”, se realiza la confrontación de la dosis mínima letal con diferentes tipos de sueros antibotulínicos. Estas mezclas se inocularán en igual volumen a los ratones experimentales y a los que sobrevivan, se les habrá inoculado la mezcla de “dosis mínima letal” más el antisuero de un tipo que haya sido capaz de neutralizar.

La detección molecular por PCR evita el tiempo necesario para el cálculo de la dosis mínima letal (DLM) y la prueba de neutralización.

Detección de anticuerpos contra la toxina botulínica (véase la muestra recomendada después en la sección Prueba ofrecida por IVAMI y muestras requeridas)

• Pacientes tratados con toxina botulínica diluida, como los que reciben botox para tratamientos estéticos o médicos (e. gr. dolor por neuralgia del trigémino facial), para detectar la presencia de anticuerpos que impidan su acción.

• Pacientes con sospecha de botulismo infantil o botulismo en adultos a los que no se les ha podido encontrar la bacteria Clostridium botulinum toxina en heces o suero.

• Personas vacunadas que estén interesadas en comprobar el estado de la protección.

La toxina botulínica de Clostridium, en diluciones muy altas, se ha utilizado por administración local para tratar procesos espásticos. Estos procesos han demostrado ser un remedio útil. Estos procesos suelen ser espásticos crónicos por lo que requieren que la toxina se administre de forma permanente. Por ello, pueden surgir resistencias durante el tratamiento debido a la inmunización progresiva del paciente a lo largo del mismo, en cuyo caso el efecto sería limitado. Para detectar esta inmunización se requiere medir con precisión y sensibilidad la existencia de anticuerpos contra la toxina botulínica A y/o B.

El método de referencia aceptado para detectar y cuantificar los anticuerpos contra la toxina botulínica es la prueba de neutralización en ratones (Mouse Neutralization Assay), en la que una dilución de toxina botulínica, cuantificada por la dosis letal al 50% para ratón (DL50), se mezcla con varias diluciones de base 2 o base 4 del suero/plasma, y después de la incubación cada una de ellas se inocula por vía intraperitoneal a grupos de ratones. La dilución más alta del suero de prueba que reduce la toxicidad corresponde al título de anticuerpos contra la toxina botulínica correspondiente. Esta dilución, comparada con un estándar internacional, permite obtener resultados en unidades internacionales (UI/mL) (1 UI se define como la cantidad de anticuerpo que neutraliza 10.000 LD50 de las toxinas A o B, o 1000 LD50 del tipo E). La cantidad de toxina utilizada en las pruebas es la que es neutralizada por 0,02; 0,005 y 0,0125 UI/mL de antitoxina para los tipos A, B y E, respectivamente (Hatheway et al. 1984). Los sueros que protegen a los ratones del título de 1:4 se reportan como <0,08 UI/mL para el tipo A, o <0,02 UI/mL para el tipo B. La prueba es laboriosa, costosa y de larga duración en su realización, por lo que se han buscado alternativas basadas en métodos de enmzimoinmunoanálisis (ELISA) utilizando microplacas recubiertas con toxina botulínica. Sin embargo, los valores obtenidos por ELISA a veces no se correlacionan totalmente con la prueba de neutralización en ratones.

Antes del paso de la prueba de neutralización es necesario calcular la dosis mínima letal (DLM) de la toxina. El cálculo de la dosis mínima letal se realiza mediante diluciones base 10 del filtrado del cultivo, diluyendo la mitad con solución salina fisiológica para obtener la misma dilución que la toxina mezclada con suero o plasma del paciente, e inoculando cada mezcla de dilución a ratones de laboratorio. Así se calcula la dilución máxima (más alta) que provoca la muerte de los animales infectados. El volumen inoculado que ha causado la muerte de los animales contiene una dosis letal mínima (DLM).

Una vez conocida la dosis mínima letal, calcular la dosis mínima no letal (dmnm) correspondiente a la cantidad mínima de toxina en presencia de una cantidad constante de antitoxina, que no mate a los ratones inoculados. Esta cantidad de toxina es neutralizada por las unidades correspondientes de antiotoxina A o antitoxina B. La dosis mínima no letal se llama porque es la cantidad mínima de toxina que no causa la muerte de los ratones en presencia de la antitoxina .

Pruebas ofrecidas por el IVAMI y muestras requeridas:

• Detección de la toxina botulínica en casos o brotes humanos de botulismo alimentario:

• Suero del paciente (5 mL como mínimo) obtenido más recientemente para la inoculación en ratones y tipificación de la toxina, si los ratones estaban afectados.

• • En los casos de botulismo infantil o botulismo intestinal, la toxina botulínica puede detectarse en las heces de los niños/pacientes, pero es más aconsejable realizar un cultivo previo de heces.

• Detección de la toxina y/o Clostridium botulinum en los alimentos ingeridos, sospechosos de causar botulismo, o en los alimentos sometidos a control

• • Muestra del alimento sospechoso o controlado (se recomienda al menos unos 100 gramos) para preparar una muestra destinada a la inoculación de ratones y a la detección de la presencia de la toxina preformada en los alimentos, así como para realizar un cultivo para obtener el filtrado para inocular a los ratones y determinar si había una bacteria productora de toxina en la muestra; Si sólo tiene restos de comida, se recomienda enviar toda la cantidad disponible.

• Detección de Clostridium botulinum en casos de botulismo infantil o botulismo intestinal

• • Heces en casos de botulismo infantil o botulismo intestinal por colonización intestinal (10 g), para cultivo y detección de toxinas en filtrado de cultivo por inoculación a ratones.

• Detección de Clostridium botulinum en casos de botulismo de heridas

• • Exudado de heridas en casos de sospecha de botulismo de heridas, para cultivo y detección de toxinas en filtrado de cultivo por inoculación en ratones. Si la muestra es transportada por vía aeróbica, el Clostridium botulinum puede haber sido inactivado, sería más conveniente realizar una prueba molecular para detectar la presencia de los genes del Clostridium botulinum y en caso de ser positivo, identificar el tipo de toxina botulínica mediante la detección de los genes correspondientes a cada tipo de toxina.

• Detección de Clostridium botulinum en muestras de lodos de agua dulce o sedimentos marinos acuáticos, y otros productos no incluidos en los apartados anteriores

• • Muestras de 100 g aproximadamente para realizar un cultivo de crecimiento de Clostridium botulinum y obtener un filtrado de cultivo para inocular a ratones.

• Detección de anticuerpos anti toxina botulínica en suero o plasma

• • Suero o plasma (unos 10 mL), para comprobar la existencia de anticuerpos de neutralización en suero o plasma frente a diferentes toxinas disponibles en el laboratorio. Esta prueba es de interés para determinar la presencia de anticuerpos específicos en personas tratadas con toxina botulínica, en pacientes con sospecha de botulismo infantil, en adultos que no han podido encontrar la bacteria en las heces, o en individuos vacunados para comprobar el estado de protección. En los casos de personas tratadas con toxina botulínica debe indicarse el tipo de toxina administrada al paciente.

Tiempo para informar de los resultados (TAT)

• No podemos dar tiempos exactos. Si la prueba es sólo para la detección de la toxina por inoculación en ratones y el resultado es negativo, el informe de los resultados sería un máximo de una semana. Si las pruebas incluyen el cultivo de la muestra, y luego la detección de la toxina hecha por la inoculación de un filtrado de cultivo de ratones, el tiempo sería de dos semanas. Si alguna de estas pruebas de inoculación en ratón, extracto de una muestra o filtrado de cultivo, fuera positiva, habría que realizar la prueba de neutralización en ratones para corroborar que se trata de toxina botulínica e identificar su tipo mediante pruebas de neutralización, el tiempo de realización es de 15 días.

• Las pruebas de PCR en tiempo real el informe son en 3 o 4 días.

Formulario con las características del producto y la/s prueba/s elegida/s

• Si se solicita la realización de pruebas con el producto se debe presentar un escrito en el que se indiquen las características del producto y las pruebas elegidas a realizar con la muestra enviada.

Volumen de la muestra

• Ver en cada caso, según el tipo de pruebas que ofrezca el IVAMI.

Condiciones de almacenamiento y envío de las muestras

• Se envían en las condiciones en que se encuentra habitualmente la muestra, protegidas para su transporte. En el caso de muestras que puedan descomponerse por estar contaminadas con bacterias, o por su propia orgánica (perecederos, sueros de origen animal o humano, heces, lodos, … ..), las muestras deben ser almacenadas y enviadas congeladas, o al menos en las condiciones que aseguren el enfriamiento durante el transporte (con el contenedor de la muestra dentro de una caja -de poliestireno expandido- (de corcho blanco) con paquetes de frío congelado. Nota: este organismo por sí mismo no supone un riesgo de contaminación por exposición biológica.

Coste de las pruebas

• Detección de toxinas en casos / brotes humanos de botulismo de origen alimentario

• Inoculación en ratones con suero del paciente o extracto de alimentos ingeridos ………………………………. ……………………………………………………………………………………………………………Consultar [email protected]

• • Si es positivo, prueba confirmatoria de neutralización e identificación del tipo de toxina …………….. …………………………………………………………………………………………………………..Consultar [email protected] .

• Detección de toxina y/o Clostridium botulinum en alimentos ingeridos, sospechosos de causar botulismo, o alimentos sujetos a control

Detección de Clostridium botulinum en casos de botulismo infantil o botulismo intestinal

• Opcional: Prueba de inoculación en ratones con suero o extracto de alimentos ingeridos ………………………………….. ……………………………………………………………………………………………………………Consultar [email protected]

• Recomendado. Prueba de cultivo, seguida de inoculación en ratones con el filtrado del cultivo ………………………….. …………………………………………………………………………………………………………..Consultar [email protected]

• Si es positiva, prueba de confirmación para la neutralización e identificación del tipo de toxina ……………………. …………………………………………………………………………………………………………..Consultar [email protected]

• Detección de Clostridium botulinum en casos de botulismo por heridas

• Prueba de cultivo, seguida de inoculación en ratones con filtrado de cultivo ……………………. Consultar [email protected]

• Si es positivo, prueba confirmatoria de neutralización e identificación del tipo de toxina …………….. …………………………………………………………………………………………………………..Consultar [email protected]

• Detección de Clostridium botulinum en muestras de lodos/agua dulce o sedimentos marinos, y otros productos no incluidos en los apartados anteriores

• • Prueba de cultivo, seguida de inoculación de ratones con el filtrado del cultivo ……………………. Consultar [email protected]
  • Si es positivo, prueba confirmatoria de neutralización e identificación del tipo de toxina ………………. …………………………………………………………………………………………………………..Consultar [email protected]

Detección de toxina antibotulínica en suero o plasma (se refiere a un tipo de anticuerpo, por lo que debe indicarse el tipo de toxina administrada al individuo) ……………………………………………….. Consult [email protected]