Ciclo cellulare lungo la radice primaria del mais
La radice primaria del mais è stata divisa in segmenti consecutivi che indicavano i limiti del cappello radicale, della zona di allungamento del meristema apicale e della zona di differenziazione, secondo i risultati precedenti (Alarcón et al., 2016). La distanza dall’RCJ all’apice della radice è stata stimata in 457 µm, che è stata rimossa prima di dividere la radice in diverse zone. La zona meristematica apicale della radice (MZ) si trova nella parte più apicale di 1,5 mm di radice dalla RCJ e la zona di transizione (TZ) continuava fino a 3 mm. La zona di allungamento veloce (EZ), dove le cellule si sono allungate rapidamente, è stata assegnata a 3-6 mm; e nelle regioni lontane da 6 mm abbiamo osservato che il tasso di allungamento delle cellule inizia a diminuire, indicando la zona di terminazione della crescita (Verbelen et al., 2006). Le zone situate a 12-20 mm e 20-30 mm da RCJ sono zone di differenziazione (DF), dove le radici laterali iniziano il loro sviluppo. Sezioni simili di radici sono state fatte in Arabidopsis, dove la radice è stata sezionata in cinque sezioni che sono più corte di quelle della radice del mais (Cools et al., 2010). Recentemente, è stata riportata un’espressione genica differenziale lungo la radice di Arabidopsis, e i geni repressi o indotti variano soprattutto nel passaggio dalla zona meristematica a quella di transizione, nonché dalla zona di transizione a quella di allungamento (Chaiwanon e Wang, 2015).
Il limite del meristema radicale è determinato dall’uscita del ciclo cellulare e dall’equilibrio tra divisione cellulare e allungamento cellulare (Perilli et al., 2012). Il profilo della citometria a flusso mostra la progressione del ciclo cellulare lungo la radice primaria, e i dati che mostrano il numero di cellule relative alle fasi del ciclo cellulare indicano l’attività cellulare in diverse zone della radice. Pertanto, quando le cellule escono dal ciclo cellulare, potrebbero smettere di pedalare. Inoltre, si presume generalmente che l’uscita delle cellule dal ciclo cellulare avvenga dopo la mitosi, e la decisione di entrare in un nuovo ciclo cellulare viene presa nel punto di transizione G1-to-S in risposta a fattori di crescita e vari ormoni (Gutierrez et al., 2002; Inzé e De Veylder, 2006; Polyn et al, 2015).
Nella Fig. 1 mostriamo che, in radici di 150-160 mm cresciute a 30°C, il meristema è praticamente limitato alla MZ, la zona 0-1,5 mm da RCJ dove le percentuali di cellule in fase G0/G1-, S-, e G2/M erano circa 27, 23 e 39, rispettivamente (Tabella 1). La durata relativa per G1, S, G2 e M nel meristema di Allium è stata stimata come 26,5, 44,5, 16,5 e 12,5%, rispettivamente (Giménez-Martín et al., 1977), e queste percentuali sono molto simili in altre specie. Anche se i nostri risultati hanno riportato che il meristema del mais ha una percentuale inferiore di cellule in fase S, i valori (23%) erano sufficienti per indicare la progressione del ciclo cellulare (Reichheld et al., 1999). Queste proporzioni relative cambiano straordinariamente quando si analizza la TZ, in questa zona. Le percentuali erano 9, 10 e 68%, per le fasi G0/G1, S e G2/M, rispettivamente. Questo risultato suggerisce che le cellule hanno iniziato a lasciare il ciclo cellulare quando hanno raggiunto 1,5 mm da RCJ. Inoltre, le percentuali in EZ hanno suggerito che a 3 mm le cellule sono fuori dal ciclo cellulare (Fig. 1, Tabella 1). Inoltre, la diminuzione della percentuale di cellule nelle fasi G0-G1- e S è stata compensata da un aumento in G2-M (Tabella 1, Fig. 2). Questi risultati mostrano chiaramente che le cellule fermano il ciclo cellulare quando sono in fase G2.
Distribuzione della popolazione cellulare nelle diverse fasi del ciclo cellulare lungo l’apice della radice. Le radici sono state coltivate idroponicamente a 30°C fino a raggiungere 150-160 mm di lunghezza. I dati provengono da un singolo esperimento rappresentativo utilizzando almeno 10.000 cellule nelle stime delle percentuali a diverse distanze dal RCJ. Gli esperimenti sono stati eseguiti in triplicato.
Tabella 1.
Effetto della temperatura sul ciclo cellulare nelle diverse zone dell’apice della radice del mais
Effetto della temperatura sul ciclo cellulare lungo l’apice della radice del mais. Istogrammi di frequenza del contenuto di DNA che rappresentano le cellule di diversi segmenti dell’apice della radice di mais coltivati a 20°C e 30°C. La colonna di sinistra rappresenta gli istogrammi di radici cresciute a 30°C; la colonna di destra sono di radici cresciute a 20°C. Le radici sono state divise in diversi segmenti: 0-1,5 mm (A,G); 1,5-3 mm (B,H); 3-6 mm (C,I); 6-12 mm (D,J); 12-20 mm (E,K) e 20-30 mm (F,L). I dati provengono da un singolo esperimento rappresentativo utilizzando almeno 10.000 cellule. Gli esperimenti sono stati eseguiti in triplicato.
È stato riportato che la maggior parte dei tipi di cellule lascia il meristema in fase G1, e ultimamente la transizione G1-to-S viene innescata solo nelle cellule del periciclo per iniziare la radice laterale (Vanneste et al., 2007). Nel periciclo dell’Arabidopsis, le cellule adiacenti ai poli del protossilema sono state proposte per continuare il ciclo cellulare senza interruzione quando passano attraverso le zone di transizione, allungamento e differenziazione (Dubrovsky et al., 2008). Queste cellule sono le uniche che si dividono per iniziare le primordiali radici laterali. Tuttavia, il resto delle cellule che costituiscono la radice non si divide. Quindi, le cellule epidermiche e della corteccia che costituiscono la maggior parte dei tessuti della radice non continuano il loro ciclo quando lasciano il meristema radicale.
Nella nostra analisi abbiamo osservato un notevole aumento delle cellule in fase G2 in TZ e EZ. Questo risultato suggerisce che le cellule che lasciano il meristema in fase G2 non subiscono la mitosi, ma si fermano a questa fase G2 e vi rimangono. Noi ipotizziamo che le cellule che escono dal meristema in fase G1 o S continuano il ciclo cellulare fino a G2, dove si fermano. Questo si basa sull’osservazione che la diminuzione della percentuale di cellule in G0/G1 tra MZ e TZ (29,7%) è compensata da un aumento in G2 (28,8%) (Tabella 1, Fig. 2). Una debole diminuzione della percentuale di G2 si ha tra la EZ e l’estremità basale della DZ (20-30 mm dalla RCJ). Questa piccola diminuzione, insieme alla diminuzione dei nuclei iperploidi, è compensata da un aumento dei livelli ipoploidi (Tabella 1).
D’altra parte, è stato riportato che le TZ nella radice apicale del mais non sono impegnate in divisioni mitotiche, e in questa zona i nuclei postmitotici si trovano in una posizione centrale all’interno della cellula (Baluška et al., 2001). Inoltre, non sono state osservate figure mitotiche lungo la zona della radice; l’iniziazione di primordi di radici laterali è stata osservata tra 20-25 mm da RCJ (Alarcón et al., 2016). In Arabidopsis, la distanza media alla prima mitosi nel periciclo è di 3194 µm e la prima mitosi è stata osservata a 2205 µm dalla punta della radice (Dubrovsky et al., 2001). Nella radice di mais, solo a 20-30 mm da RCJ, alcune cellule del periciclo opposte allo xilema hanno mostrato citoplasma condensato, indicando che stanno rientrando nel ciclo cellulare (Alarcón et al., 2016). Queste differenze potrebbero essere causate dalla maggiore velocità di allungamento delle radici nel mais che cresce 80-90 mm/giorno, mentre l’Arabidopsis allunga solo 10 mm/giorno (Dubrovsky et al., 2001).
È stato dimostrato utilizzando un’analisi microscopica quantitativa tessuto-specifica che alcune cellule di corteccia ed epidermide erano nel primo endociclo (contenuto di DNA tra 4C e 8C) al loro inizio di allungamento. Inoltre, i nuclei degli elementi del metaxylem nella zona di transizione hanno compiuto uno o due endocicli raggiungendo 32C al loro inizio di rapido allungamento (Baluška, 1987, 1990; Baluška e Kubica, 1984; Baluška et al., 1995). Recentemente, è stato descritto che l’endoreduplicazione avviene nelle piante prima che le cellule inizino la differenziazione (De Veylder et al., 2007). Tuttavia, non abbiamo osservato un numero rilevante di nuclei con livello di ploidia superiore a 4n. Inoltre, se l’endoreduplicazione fosse un processo comune nella punta delle radici del mais, ci aspetteremmo che l’iperploidia aumentasse man mano che si analizzavano le zone più lontane dalla RCJ. Tuttavia, l’iperploidia non solo non è aumentata nelle zone di allungamento, ma è diminuita (Tabella 1).
È stato riportato che le cellule del periciclo rimangono in fase G1 fino a quando non rientrano nel ciclo cellulare (Vanneste et al., 2007). Tuttavia, le cellule del periciclo rappresentano solo una piccola frazione della quantità totale di cellule che formano le punte delle radici; le cellule epidermiche e della corteccia sono i tipi di cellule più abbondanti nell’apice della radice. Quindi, se circa il 70% delle cellule totali abbandonano il meristema in fase G2, la maggior parte delle cellule epidermiche e della corteccia devono essere in G2 quando lasciano il meristema. Si presume che l’allungamento delle cellule epidermiche e della corteccia controlli la crescita longitudinale della radice (Alarcón et al., 2014b). Pertanto, le cellule coinvolte nel processo di differenziazione che porta all’allungamento della radice dovrebbero essere in fase G2.