Linda Boettger1,2 and Diane P. Genereux2
1. Stanford University School of Medicine; 2. Broad Institute of MIT and Harvard
純血種の犬や、時には一代雑種でさえ、犬種推定サービスは、犬の飼い主がすでに知っていることを確認するだけのことがよくあります。 血統書が利用できることもあり、純血種の祖先を何世代もさかのぼって、そのペットの祖先について基本的に完全な情報を提供することができます。 また、飼い主の豊富な経験から、「あの耳と鼻は、ビーグルの血を受け継いでいるに違いない」と直感される場合もある。 これとは対照的に、雑種犬の祖先を調査するためにDNAを用いた推論を行うと、しばしば驚くべき結論が導き出されます。 愛する雑種犬の祖先に関する家族の論争を解決するために使用することができ、少なくともペットの健康を守る見込みを提供することができる。 例えば、雑種犬が癌のリスクが高いことが知られている品種の祖先を持つことがわかれば、腫瘍のスクリーニングをより頻繁に行うことが推奨されるかもしれません。 ここでは、祖先推定サービスを検討している人や、意外な結果の解釈に悩む人に役立つ可能性のある背景を紹介します。 まず、雑種犬の魅力的で複雑なゲノムを生み出す生物学的プロセスについて説明し、次に、既存のアプローチがどのようにこの複雑なゲノムを分離し、品種の祖先に関する洞察を得ようとしているかを概観します。 最後に、祖先の推定を損なう可能性のあるいくつかの課題について議論し、今後数年間でこれらの課題を解決するためにどのような種類の情報が必要とされるかについてコメントします。 雑種とは何か
図1
雑種の正確な定義に到達するためには、犬がどのように最初に発生したかを考えることが有効である。 利用可能なデータは、最初は人間との偶発的な相互作用が彼らの古代の起源を説明できることを示唆している（Larson and Fuller, 2014）。 仮に、古代のオオカミの中には人間を警戒していたものと、比較的快適だったものがあると仮定する。 この解釈では、人間の人口が拡大するにつれて人間の食べかすが急増したため、群居性の高いオオカミに新たな主食が提供された可能性があります。
進化のシナリオで必要とされるように、これら 2 つの初期の集団を区別する形質に遺伝的基盤があったとすれば、それは個々のオオカミが人間のそばで快適に過ごせるように調節する一連の変異であると考えられます。 ここで重要なのは、このシナリオでは、犬は人間によって家畜化されたのではないということである。 その代わりに、人間は、偶然にも、遺伝的に人間に対して少なくとも少しは寛容になる素因を持っていたオオカミの一部によって、自己家畜化を可能にする環境を作り出しただけなのだ。 現代の品種の起源。 正確な時期についてはまだ議論の余地があるが、一般的には1万年から4万年前の間にユーラシア大陸で祖先のオオカミとは異なる集団として犬が出現したと考えられている（Larson and Fuller, 2014）。 このシナリオでは、ほとんどのオオカミが人間を警戒し、野生では自然淘汰され続ける一方で、少数のオオカミは人間の近くでの生活に耐えることができ、おそらく人間の食物廃棄物を利用することができたと考えられている。 このようなオオカミの一部が、やがて人間のそばで生活することのできる、遺伝的に異なる動物の集団を生み出すことになったのである。 特定の犬種が生まれたのはずっと最近のことで、ほとんどの犬種は150年未満で形成された（Larson et al.） この過程で、闘犬、牧童、狩猟、あるいは良き伴侶といった特定の形質が選択され、異なる系統に繁殖された。
現代の犬種は、オオカミの祖先から犬が確立した後、150年ほど前のヴィクトリア時代に出現したと一般に考えられている。 この推測は、人間が特定の仕事に役立つと考えられる特徴を共有する犬の交配ペアを作り、特定の特徴をコード化する遺伝子変異がますます豊かになる犬の明確なグループを生み出すという観察からきている（Larson et al.、2012）。 どのような進化の過程でもそうであるように、関連する突然変異は最初はランダムに発生し、後に選択的交配によって有利に働くようになった。 アメリカンケネルクラブやインドケネルクラブなど様々な団体が、最終的に個別の犬種を定義し、血統書に記載されている個体が全祖先となる犬を純血種と定義するようになった（「Inherited Defects in Pedigree Dogs. Part 2: Disorders That Are Not Related to Breed Standards,” 2010）。 最初に明確な犬種を確立し、現在も維持している選択的繁殖の観点から、雑種は遺伝的に異なる複数の系統を祖先に持つ犬と定義することができる。
したがって、祖先推定の目的は、雑種犬の遺伝情報を使って、その祖先の中にどの犬種が存在し、それらの相対的な遺伝的寄与を推定することである。 祖先推定のためのDNAの分離
図2
祖先推定の最初のステップは、遺伝子評価のためのDNAを収集し抽出することである。 幸いなことに、唾液は素晴らしいDNA源であり、ほとんどの飼い主はそれを集めるのが非常に簡単であることに気づきます。 ジェノタイピングサービスが提供する唾液採取用綿棒は、犬の口の中に少し置くだけで、たくさんの細胞で覆われるのが普通です。 これらの細胞には、唾液中に浮遊し、免疫反応を助ける白血球と、口の中を覆う上皮細胞があり、通常24時間ごとに入れ替わっている。 細胞が採取されると、その綿棒（図2A）は家系鑑定会社に郵送される。 そこでは、細胞膜が壊され（図2B）、DNAを含む細胞核（図2C）が遊離し、その後、核からDNAが遊離する（図2D）。 その後、タンパク質やその他の生体分子を洗い流して、高品質の DNA サンプルを得ることができます (図 2)。 祖先推定に必要なDNAの単離。 唾液採取器(A)は、犬の口の中でわずかな時間を過ごす間に、多くの上皮細胞や免疫細胞を採取する(B)。 次に、細胞から核（C）を分離し、溶解してDNA（D）を遊離させ、これを洗浄して遺伝子型決定や配列決定に使用することができる。 例えば、今年の夏、私たちは6頭の子犬から毎週唾液を採取しました。 驚いたことに、唾液中の白血球と上皮細胞の比率は、個体によって、また週によって大きく異なることがわかった。 さらに驚いたのは、ある仔の唾液の細胞数が、その姉や弟よりも常に非常に多かったことである。 私たちはいずれ、この劇的な変化を説明できるものを見つけ出したいと思っています。 今のところ、最も少ないサンプルでも、祖先の推定に十分なDNAが含まれていることが分かっているので、安心です。 染色体の継承と交換
図3
ヒトでも犬でも、母親と父親は子供のゲノムにほぼ等しく貢献する。 犬のゲノムは38対の常染色体（ヒトは22対）と1対の性染色体（ヒトも1対の性染色体）に分かれる。 38対の犬の常染色体は、それぞれお母さんから卵子によって受け渡される染色体と、お父さんから精子によって受け渡される染色体から構成されています。 ミトコンドリアは代謝にかかわる多くの遺伝子を含む小さなDNA断片ですが、そのゲノムは常にママから提供されます。
雑種の遺伝的起源をモデル化するために、まず2頭の純血種の犬、オスのラブラドルレトリバーとメスのプードルの交配を考えてみましょう。 雄の精子と雌の卵子がそれぞれ染色体を1本ずつ持っていて、それが結合して、それぞれの親が提供した染色体を1本ずつ持つラブラドール-プードルのミックスが生まれます
図3. 雌のプードルの卵子と雄のラブラドールレトリーバーの精子が受精し、ラブラドールとプードルのミックスが形成される。 染色体1対に対して、母親（紫）と父親（ピンク）が1本ずつ寄与している。 注：この図と以降の図では、わかりやすくするために、39対のイヌの染色体のうち1対だけを示しています。 雌のビーグルの卵が雄のパグの精子と受精し、パグビーグルミックスが生まれる。
図4
平行交配では、雌のビーグルマムと雄のパグの交配が行われ、雄のパグビーグルミックスが生まれる。 メスのビーグルの卵とオスのパグの精子が受精し、パグビーグルミックスが誕生する。 染色体1対に対して、母親（黒）と父親（青）が1本ずつ寄与しています。
雑種がどのようにして複数の異なる品種からの遺伝子を含むようになるかを理解するためには、次の世代に進まなければなりません。 先ほどと同じように、お母さん（ここではラブラドゥードル）とお父さん（ここではパグル）は、それぞれのペアで染色体の1つを提供します。 しかし、両親は自分たちが受け継いだ染色体そのものを受け継ぐのではなく、自分たちの両親の染色体の断片を組み合わせた組換え染色体を提供します（図5）。 この例では、4つの犬種の祖先から受け継いだDNAを持つ子犬が「雑種」と呼ばれることになります。 ラブラドール・プードルのメスの卵子とパグとビーグルのミックスのオスの精子が受精し、雑種が生まれる。
図5
Figure 5. 雌のラブラドール・プードルの卵と雄のパグ・ビーグル・ミックスの精子が受精し、雑種が形成される。 染色体1対に対して、母親からは1本（紫とピンク）、父親からは1本（黒と青）の染色体が受け継がれます。 この交配では、二人の親自身がミックスブリードである。 したがって、ラブラドールとプードルのミックスが卵を産み、パグとビーグルのミックスが精子を産むと、その染色体には2つ以上の品種のDNAが含まれます。
組み換えでは、それぞれのペアを構成する2つの染色体間で遺伝物質の公正な取引が行われます。 組換えは、2本の染色体の間で遺伝子を公平に交換することで、元の染色体の新しいバージョンを作り出します。 純血種のビーグルやプードルでも、それぞれのペアの染色体は交換されています。
純血種の犬から得た参照ゲノムと比較して雑種の祖先を推定する
局所的な祖先推定は、雑種のゲノムの各塊がどの品種に由来する可能性が最も高いかを判断することによって行われます。
ある染色体の塊がどの品種に寄与しているかを推定するためには、当然ながら、様々な品種の遺伝的寄与を区別する方法が必要になります。 幸いなことに、ゲノムの大部分はすべての犬種で非常によく似ていますが、各犬種にはその犬種に固有の、あるいは少なくとも他の犬種よりはるかに一般的な、突然変異と呼ばれる特定の遺伝的変化があります。 これらの変異の中には、特定の犬種の特徴に直接関係するものもあります。 その他の変異は、たまたまある品種に固有のものであったり、他の品種より多く見られるものですが、その品種の特定の身体的特徴との関連はわかっていません。 どちらのタイプの突然変異も、家系を推定するのに有効です。 図3-6では、品種固有の突然変異を染色体の色で表し、祖先の推定に役立てています。 図6
参照ゲノムのセットと突然変異体ゲノムを比較することによる品種先祖の推測
Figure 6. 雑種ゲノムを参照ゲノムのセットと比較することによる品種先祖の推論。 雑種犬の血統を推定するために、血統参照ゲノム（A）を収集し、目的の雑種犬ゲノム（B）と比較して、染色体塊ごとに血統を推定し、全体の血統寄与を推定することが可能です。 上の突然変異体は、パグ、ラブラドール・レトリーバー、プードル、ビーグルの祖先からの寄与がほぼ等しいと推測されます。これは、この4種の祖父母がそれぞれ1人ずついることから予想されることです。
次に雑種犬の祖先を推定する手順は次のとおりです。
- 純血種の犬から遺伝データを収集する（図6A）
- 興味のある突然変異体から遺伝データを収集する（図6B）
- 突然変異体ゲノムを参照ゲノムと比較し、各染色体塊について品種起源について最善の推定を行う。 図6C）
雑種のゲノムのほんの一部からでも、祖先推定に役立つデータがある
犬のゲノムには約2.5倍の大きさがある。これはDNAを構成するAs、Ts、Cs、Gのヌクレオチドです。 これは、ヒトのゲノムを構成する約30億個のヌクレオチドと大差はありません。 もちろん、理想的な世界では、すべての犬から全ゲノム配列データを収集することは経済的に可能であろう。 この20年間で、私たちはこの目標に少しずつ近づいてきました。 2001年に初めてヒトゲノムの完全配列が発表されたとき、約30億の塩基配列の解読には27億ドルの費用がかかりました。 しかし、ゲノム解読のコストが大幅に下がったことで、世界中のヒトの全ゲノム配列のカタログを作成する「1,000ゲノムプロジェクト」のような大規模な試みが可能になりました。
こうした価格低下にもかかわらず、ここBroad InstituteのGenomics Platformでは、犬の全ゲノム配列を決定するのに約1,400ドルかかっています。 この価格は、以前の価格と比較すると大幅に改善されていることは確かですが、依然として相当なものです。 幸い、ジェノタイピングはより安価で、なおかつ多くの情報を得ることができる代替手段である。 全ゲノム配列決定とは対照的に、ジェノタイピングはゲノム内のヌクレオチドのサブセットをアッセイする。 例えば、犬ゲノムの場合、最も一般的なチップは約17万件の変異を測定します。 インピュテーションは、いくつかのヌクレオチドからの遺伝子型情報を使用して、他のヌクレオチドについて情報に基づいた推測を行います。
図 7
雑種のゲノムのわずか 0.000068% (25 億分の 170,000) からのデータで、ゲノム全体に対する適切な代理人を得られるとは最初は考えにくいでしょう。 その答えの一つは、先に述べた組換えプロセスの詳細にある。 世代を経るごとに、ある祖先から受け継いだ染色体の塊はどんどん小さくなっていきます。 このように全体的に長さが減少するにもかかわらず、染色体の塊は何世代にもわたって、ゲノム全体と比較して大きなままです。 したがって、いくつかの重要な注意点、およびいくつかの誤差が不可避的に生じることを認識した上で、突然変異体のゲノムの1塩基の同一性を利用して、隣接する塩基の同一性について推測することは、一般的に妥当であると言えます（図7）。 この方法はインピュテーションと呼ばれ、混血犬において比較的低コストで祖先の構成要素を推定する機会を大幅に改善した。 インピュテーションは、あるヌクレオチドからの遺伝子型情報を用いて、他のヌクレオチドについて情報に基づいた推測を行う。 プードル（紫）とラブラドール・レトリーバー（ピンク）のDNAが組み合わされてできた染色体では、ラブラドール・レトリーバーが寄与した1位と2位の犬種祖先を特定することにより、周辺領域の犬種起源を正しく推測することができます。 一方、3番目の位置は、染色体の塊の間のブレークポイントに近く、その部位からのデータは、サンプリングした位置の左側の位置の起源について正しい推測につながるが、右側の位置についてはそうではない。
ジェノタイピングチップはどのように機能するか
Affymetrix や Illuminaなどの企業が設計した犬のジェノタイピングチップは、病気に関連する変異を特定するのに最も適したものです。 その結果、臨床的に有益である可能性が最も高い変異のサブセットのみが、それぞれの犬について調査され、コストを抑えることができます。 地球上のすべての生物のDNAでは、A（アデニン）はT（チミン）と対になり、C（シトシン）はG（グアニン）と対になります。 したがって、DNAの配列「ATCG」は相補配列「TAGC」にくっつくことになる。 しかし、1文字の違い（例えば、”TGGC”）でも、2つのDNAが互いに結合するのを妨げることができる。 ジェノタイピングチップは、この選択的結合の原理を利用して、与えられた犬の中にどのような変異が存在するかを判定する。 DNAプローブは、犬のDNAのうち、変異したDNAと変異していないDNAを交互に結合するように設計されている。 これらの短い配列は、一般に「チップ」または「アレイ」と呼ばれる小さなスライドグラスの上部に取り付けられる（図8）。 各犬がどのような変異を持っているかを調べるためのジェノタイピング。 DNAプローブ（目的の変異に相補的な短い配列）はジェノタイピングアレイ上の異なる位置に存在する。 ここでは、チップによってアッセイされる数千の変異のうちの1つを検出する様子を示している。 犬のDNAを加え、チップ上のDNAと結合させた後、結合しなかったDNAを洗い落とす。 次に、残った犬のDNAに結合する蛍光分子を添加する。 このようにして、ジェノタイピングアレイのどの領域が光っているかを視覚化することによって、犬に存在する突然変異を同定することができるのです。 次に、結果を解釈する上で重要となる蛍光性分子にくっつくことを得意とする化学物質を犬のDNAに付着させる。 犬のDNAはチップの上で洗浄され、それぞれの鎖が相補的なプローブ配列と結合する。 このようにして、突然変異体のDNAの断片がジェノタイピングチップ上の適合するプローブを見つけるのである。 2つの特徴により、特異的な結合が保証され、したがって信頼できるデータが得られる。 まず、ジェノタイピングプローブはゲノムの異なる部分に由来する変異体DNAと結合することはできない。 第二に、その犬がたまたまその特定の変異（すなわち、上に示した “A “の配列）を持っていない限り、その配列の変異型と結合することはできない。 結合しなかったDNAはスライドから洗い流され、最後にプローブとの結合に成功した残りのDNAに蛍光分子が結合される。 各プローブはアレイ上の特定の場所に作られたので、アレイ上のどの小さなスポットが光っているかを観察することによって、その犬がどの突然変異を持つかを解釈することができる。 関連するゲノムが参照セットに存在する場合にのみ、祖先を推定することができる。
図9
図9。 関連するゲノムが参照集合に存在する場合にのみ、祖先を推定することができる。 参照ゲノムによく含まれ、ジェノタイピングアレイでよくサンプルされる品種（例えば、上記のシナリオではプードル、パグ、ラブラドールレトリバー）については、祖先推定作業は通常、その品種からの最近の祖先によって貢献したDNAの存在とおおよその割合の両方を特定することに成功する。 しかし、参照ゲノムにあまり含まれていない品種（例えば、上記のシナリオではビーグル）については、染色体の塊が、より多く含まれている品種（例えば、上記のシナリオではバセットハウンド）に誤って帰属してしまい、雑種の祖先を正しく評価できないことがよくある＜3902＞ ＜9156＞ いくつかの問題は、単に特定の品種から由来する雑種の祖先を過小評価する結果となるが、他の問題によって正しい品種が全く特定できないこともある。 これらの問題のうち最も重大なものは、参照データセットから真の祖先品種が欠落していることです（図9）。 犬種の祖先は、雑種のDNAの塊を既知の犬種の純血種と比較することによって推定されるので、もし参照データセットに犬種がなければ、たとえ雑種のDNAの非常に大きな割合を占めていたとしても、その犬種を検出することはできないのです。 この問題は、最終的には公認犬種の参照ゲノムを含めることによってのみ解決される。それまでの間、もし自分の犬が特定の希少犬種の祖先を持つかどうかを知りたい場合は、その犬種の祖先調査を行うことができる会社かどうかを確認することが重要である。 参照集合から目的の品種が欠落していることが分かっていても、祖先推定を進めることにした場合、推定された祖先のリストからその品種が欠落していても、雑種犬が本当にその特定の祖先を持たないかどうかについての情報は得られないことを心に留めておくことが重要である
遺伝子型決定のために選択した突然変異も、混血犬で正確に識別できる品種祖先を決める。 ジェノタイピングアレイは、一般的な犬種に存在する変異をより多く含む傾向があります。 つまり、プードルやジャーマンシェパードの染色体の塊は、これらの犬種に共通する変異の多くがジェノタイピングアレイで測定されるため、特に同定しやすいと考えられます。 多くの突然変異は、ニューギニアシンギングドッグやスカイテリアなどの希少品種のDNAの塊を特定するのに役立つが、これらの突然変異の一部は、広く使われているジェノタイピングアレイでは表現できない可能性があり、これらの品種の特定が難しくなる可能性がある。 この問題は、最終的には配列データを用いた品種参照データセットを作成することで解決されるであろう。このデータセットでは、より多くの変異を解釈することができ、特定の品種からの祖先の検出に偏ることはないであろう。
雑種とその純血種の祖先との関係も品種判別の信頼性に影響している。 特に、近親者（親など）である純血種の祖先からの DNA は、最近の祖先からの突然変異がより情報量の多い長い塊に存在するため、品種祖先を特定することが容易となる。 例えば、雑種の染色体で観察される最初の突然変異はラブラドールにもゴールデンレトリバーにも共通するかもしれませんが、おそらく観察される1番目、2番目、3番目の突然変異はゴールデンレトリバーにのみ一緒に見られるものでしょう。 何世代も前の祖先から受け継いだDNAは短い染色体の塊として存在し、突然変異も少ないため、突然変異の祖先を特定することは困難です。 この問題は、ジェノタイピングの代わりにシークエンスデータを使用することで軽減され、すべての変異を解析することができます。 しかし、何世代も前に受け継いだDNAは、特定の品種に特徴的な染色体の塊が含まれないほど短く、全ゲノムデータを用いても雑種の祖先への寄与を検出することはできない（Li et al.、2014）。
どんな新しい技術でもそうですが、品種推定はエキサイティングな機会であると同時に、いくつかの未解決の課題をもたらすものでもあります。 自分のペットの起源についてもっと知りたいと思う多くの犬の飼い主は、どの品種が自分の雑種のユニークな遺伝に貢献したかを知る窓があることにきっと感謝するでしょう。 あなたの愛犬の高地での優れたスタミナは、ラサ・アプソの祖父母に由来すると推測する権利さえ得られるかもしれない（Li et al.） それでも、様々な問題が推論の信頼性を損なう可能性があることを念頭に置き、参考データの蓄積に伴って推論が改善されることを楽観視しつつ、飼い主には慎重であってほしいと思います。 第2部：犬種標準に関係しない障害”. 2010. 獣医学雑誌 183 (1). W.B. Saunders:39-45.
Larson, Greger, and Dorian Q. Fuller. 2014. “動物家畜化の進化”. Annual Review of Ecology, Evolution, and Systematics 45 (1):115-36.
Larson, Greger, Elinor K. Karlsson, Angela Perri, Matthew T. Webster, Simon Y. W. Ho, Joris Peters, Peter W. Stahl, et al.（2012.3.26）. “Rethinking Dog Domestication by Integrating Genetics, Archeology, and Biogeography” （遺伝学、考古学、生物地理学の統合による犬の家畜化再考）. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 109 (23):8878-83.
Li, Yan, Dong-Dong Wu, Adam R. Boyko, Guo-Dong Wang, Shi-Fang Wu, David M. Irwin, and Ya-Ping Zhang. 2014. “集団変動が明らかにしたチベタン・マスティフの高地適応”. 分子生物学と進化 31 (5):1200-1205.
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