Discusión

La microbiota humana comprende más de mil especies bacterianas distintas y desempeña un papel fundamental en la salud humana al promover el suministro de nutrientes, prevenir la colonización de patógenos y formar y mantener la inmunidad normal de la mucosa. Recientemente se ha apreciado que las bacterias intestinales comensales tienen una verdadera relación simbiótica con el huésped; dentro de este gran conjunto de bacterias, se ha afirmado que los suplementos probióticos que contienen BAL (es decir, lactobacilos y bifidobacterias) tienen una serie de efectos beneficiosos para la salud humana, como la prevención de la diarrea y la enfermedad inflamatoria intestinal o la profilaxis de las infecciones urogenitales . Sin embargo, nuestro conocimiento de las funciones bioquímicas que desempeñan las especies y cepas específicas en la salud y la enfermedad humanas es muy limitado. En este estudio nos propusimos avanzar en la comprensión de las vías de reducción de nitratos en especies bacterianas comunes seleccionadas que colonizan el intestino humano, utilizando condiciones in vitro compatibles con dietas ricas en nitratos y niveles de oxígeno encontrados en las superficies mucosas del tracto gastrointestinal. Los principales resultados de nuestra investigación indican que 1) E.coli, un anaerobio facultativo, convierte el nitrato en nitrito y posteriormente en amoníaco que se acumula progresivamente en los medios de cultivo; 2) L.plantarum, una bacteria fermentativa, cultivada en presencia de hemo exógeno y vitamina K2 realiza procesos similares; 3) las enzimas de E.coli generan un NO significativo a partir de nitrito sólo en condiciones anaeróbicas; 4) todos los cultivos de BL examinados generan grandes cantidades de ácido láctico causando una acidificación suficiente de los medios de cultivo para impulsar la desproporción de nitrito a NO.

La mayoría de los eucariotas obtienen su energía principalmente a través de la fosforilación oxidativa y deben respirar O2 para la formación de ATP, sin embargo muchas bacterias entéricas, incluyendo las cepas de E.coli K12, pueden utilizar NO3- como un aceptor de electrones alternativo cuando el O2 es limitante y el nitrato es abundante . E.coli representa el miembro modelo de las Enterobacteriaceae y, aunque esta familia constituye sólo una pequeña fracción de la microbiota intestinal, es especialmente importante porque ciertas cepas pueden causar enfermedades. También se ha demostrado recientemente que el nitrato generado como subproducto de la inflamación del huésped puede ser utilizado por E.coli durante la respiración para conferir un beneficio de crecimiento y superar a los microbios que residen en el colon y que sólo dependen de la fermentación . L. plantarum se considera un probiótico seguro y se encuentra habitualmente en el tracto intestinal de los mamíferos, así como en la saliva humana, donde se sabe que los nitratos se acumulan a niveles milimolares debido al ciclo entero-salival del nitrato, que representa alrededor del 25% del nitrato global circulante. Esta bacteria presenta la típica vía heterofermentativa facultativa de la familia de las BAL pero, de forma exclusiva para esta especie, se han identificado recientemente en el genoma de L. plantarum WCFS1 genes que codifican un sistema putativo de nitrato-reducción (narGHJI), lo que sugiere que es capaz de utilizar el nitrato como aceptor de electrones . De hecho, un análisis genético de L.plantarum publicado recientemente ha puesto de manifiesto su enorme capacidad metabólica diversa y versátil.

En nuestros experimentos se detectó una actividad significativa de la nitrato reductasa tanto en E.coli, como en L. plantarum a medida que la tensión de oxígeno disminuye desde el nivel atmosférico hacia cero. Por el contrario, B.longum infantis, un anaerobio microtolerante de origen gastrointestinal infantil, no mostró capacidad para reducir el nitrato ni siquiera a altas concentraciones. Las bifidobacterias representan hasta el 90% de las bacterias del tracto gastrointestinal de un lactante y nuestros resultados concuerdan con la observación de que la leche materna humana, que presenta niveles particularmente altos de nitrito , proporciona una fuente dietética de nitrito antes del establecimiento de la microbiota lingual e intestinal capaz de reducir el nitrato que normalmente se encuentra en la flora adulta.

En la Fig. 1 mostramos que los cultivos de E.coli que contenían 5 mM de NO3- tenían una ventaja de crecimiento competitivo con respecto a los cultivos sin adición de nitrato y, a continuación, determinamos el efecto de los gradientes de oxígeno y nitrato en la producción de nitrito y amoníaco. Nuestros resultados indican que aproximadamente 2,5 mM de NO3- con O2 al 4% o inferior es suficiente para inducir la expresión de las enzimas nitrato reductasa y que después de 24 h se acumuló una cantidad considerable de nitrito tanto en el interior de las células de E.coli como en el medio de cultivo. Un análisis molecular detallado de la regulación de las actividades enzimáticas bacterianas trasciende el alcance de este estudio, sin embargo es bien conocido que las cepas de E.coli K12 expresan tres nitrato reductasas que contienen molibdeno y que el tungsteno puede desactivar estas enzimas sustituyendo el átomo de molibdeno en el sitio activo . Encontramos que la adición de 300 μM de óxido de tungsteno a los cultivos crecidos como en los experimentos reportados en la Fig. 1 abolió casi completamente la formación de nitrito (datos no mostrados). Por lo tanto, creemos que las nitrato reductasas dependientes del molibdeno son responsables del paso crucial en la formación de nitrito. También es importante señalar que E.coli, así como muchas otras especies de bacterias, son susceptibles a la toxicidad del nitrito debido a la formación de complejos metal-nitrosilo y minimizan esta toxicidad mediante la inducción coordinada de un transportador de membrana de nitrito y otras enzimas que median en la reducción del nitrito. Una descripción completa de los genes de las enzimas nitrato y nitrito reductasa de E.coli y de la regulación y expresión de los operones puede encontrarse en las excelentes publicaciones de Stewart y Cole.

Vías de reducción de los óxidos de nitrógeno en el intestino humano

La presencia de nitrato y nitrito en el tracto gastrointestinal inferior depende de numerosos aspectos que incluyen los tipos de bacterias que colonizan el intestino y el intrincado equilibrio entre la dieta y las vías metabólicas de los óxidos de nitrógeno. Sin embargo, la producción endógena de nitrato a partir de la oxidación del NO (principalmente a través de la reacción con la oxihemoglobina) ha sido reconocida desde hace mucho tiempo como un orden de magnitud mayor que la ingesta dietética, como se demostró a finales de la década de 1970 y, más recientemente, en los estudios realizados con ratones deficientes en eNOS. En la representación esquemática de la Fig. 5 hemos resumido el vínculo entre la desnitrificación respiratoria bacteriana, la reducción de los óxidos de nitrógeno a amoníaco, la vía endógena de la L-arginina/NO sintasa y la reducción no enzimática del nitrito a NO. En el proceso de desnitrificación (cuadro rojo), el nitrato se reduce a nitrógeno gaseoso (N2) en un proceso de cuatro pasos en el que el nitrito, el NO y el óxido nitroso son aceptores de electrones en reacciones generadoras de energía. Recientemente se ha demostrado que existe una vía de desnitrificación completa, que conduce a la producción de N2, en la placa dental humana y, aunque todavía se considera de menor importancia en los seres humanos, especulamos que podría tener un papel importante bajo una tensión de oxígeno muy baja en presencia de nitrato y no se puede excluir la formación de N2 en el intestino humano. La desnitrificación y la reducción disimilatoria de nitrato a amoníaco (DNRA, cuadro azul) comparten el primer paso de reducción de nitrato a nitrito y se han asociado a esta reacción varias clases de nitrato reductasas. En la DNRA el segundo paso es la reducción directa de nitrito a amoníaco de seis electrones, que no proporciona energía pero es un proceso de desintoxicación bastante común en las bacterias anaerobias facultativas. Se ha sugerido que el DNRA representa la principal ruta del metabolismo del nitrato en el rumen de los mamíferos. Este estudio identificó el amoníaco como producto de la reducción del nitrato en las bacterias E.coli y Lactobacilli cultivadas en presencia de mM de nitrato al 4% de oxígeno o a niveles inferiores.

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La desnitrificación respiratoria también puede generar pequeñas pero relevantes cantidades de NO como producto intermedio y se ha implicado en la producción bacteriana de NO en el intestino . Otras posibles vías de producción de NO son la conversión ácida del nitrito (recuadro verde) y la oxidación de la L-arginina por las enzimas NOS (círculo marrón). En la Fig. 4C examinamos la dependencia de protones de la desproporción no enzimática del nitrito y demostramos que sólo es relevante cuando el pH intracelular o de los fluidos corporales es inferior a 5,5. Nuestros resultados también excluyeron la presencia de enzimas NOS activas en E.coli y L.plantarum, sin embargo, se sabe que las células epiteliales intestinales producen NO mediante la expresión de las isoformas NOS endotelial e inducible. Curiosamente, la producción de NO en el intestino podría ser desencadenada también por los procesos enzimáticos de las peroxidasas, que son abundantes en las células de la mucosa intestinal y se ha demostrado que utilizan el nitrito como sustrato para producir NO como parte de su acción antibacteriana.

Creemos que todas estas diferentes vías de reducción de nitratos pueden coexistir y ocurrir simultáneamente sin embargo es probable que sólo un metabolito predomine dependiendo de las condiciones fisiológicas específicas.

Significado fisiológico de la formación de NO por reducción bacteriana de nitratos

El nitrato y el nitrito dietéticos siguen siendo presentados como posibles sustancias tóxicas en muchos estudios a pesar de la creciente evidencia de que la producción de NO a partir de estos iones tiene importantes implicaciones beneficiosas para las funciones cardiovasculares, inmunitarias y gastrointestinales . En el intestino, el NO desempeña varias funciones fisiológicas, como la regulación del flujo sanguíneo de la mucosa, la movilidad intestinal y el grosor del moco. La sobreproducción crónica de NO también se ha asociado a la enfermedad inflamatoria intestinal y es probable que inhiba el crecimiento de una gran variedad de especies bacterianas. Los estudios anteriores no dejaban claro cómo las bacterias intestinales producían NO, sin embargo, Sobko et al. demostraron que, en contraste con las ratas convencionales, los niveles de NO en el intestino de las ratas libres de gérmenes son extremadamente bajos y cuando se inoculan con una flora bacteriana normal la producción de NO observada se multiplica por 10.

En nuestros experimentos las concentraciones de oxígeno y protones determinaron la ruta específica de reducción de nitrato a NO. Los resultados presentados en la Fig. 4A indican que E.coli es capaz de desarrollar una actividad enzimática de NO en condiciones anaeróbicas con concentraciones de nitrato superiores a 1 mM, posiblemente a través de la desnitrificación o de la enzima citocromo c nitrito reductasa periplásmica (Nrf), tal como proponen Corker y Poole . Esta generación de NO, sin embargo, se reduce en gran medida al 2% de oxígeno y se vuelve independiente del nitrato. Es importante destacar que nuestros datos son consistentes con el informe de Sobko y sus colegas de que E. coli generó niveles insignificantes de NO durante 24 horas de incubación con 0,1 mM de nitrato . Las BL producen cantidades considerables de NO en respuesta a la acidificación del medio debido a la acumulación de ácido láctico. La sustitución del medio de crecimiento por LMRS fresco (pH = 6,5) bloqueó casi por completo la capacidad de los cultivos de BL de convertir el nitrito en NO, pero no en E.coli. Las mediciones del pH intestinal oscilan entre 5,7 y 7,5, por lo que la desproporción de nitritos in vivo es probablemente un aspecto menor y localizado de la producción de NO. Por el contrario, esta vía es un fenómeno bien establecido en el entorno ácido del estómago (pH alrededor de 3).

En resumen, sugerimos que el NO generado por las bacterias intestinales en la proximidad de la mucosa intestinal puede ejercer los efectos beneficiosos señalados anteriormente o, a niveles más altos, interferir con estas funciones. Así pues, la formación de NO bacteriano en el intestino puede considerarse un modulador de los efectos tanto fisiológicos como patológicos.

Implicaciones fisiológicas de la formación de amoníaco bacteriano para la salud

Se sabe que las bacterias colónicas producen amoníaco a partir de la desaminación de aminoácidos o a través de la ureasa, la hidrólisis de la urea en dióxido de carbono y amoníaco, desde los estudios seminales de Vince et al. a principios de la década de 1970. Más recientemente, Cole y sus colegas informaron de que el principal producto de la reducción de nitritos en E.coli es el amoníaco, y que sólo un 1% se reduce a NO a pH neutro. Los resultados obtenidos en nuestro estudio sugieren que al menos ciertas bacterias intestinales comunes reducen principalmente el nitrito a amoníaco en lugar de NO. En sujetos sanos, en condiciones fisiológicas ordinarias, la mayor parte del amoníaco generado en el tracto gastrointestinal inferior se excreta en los fluidos corporales y es metabolizado por los hepatocitos del hígado, donde el amoníaco y el dióxido de carbono se convierten enzimáticamente en fosfato de carbamoilo, que entra en la serie de reacciones denominadas “ciclo de la urea” que conducen a la formación de urea y a su eliminación por el riñón (véase la Fig. 5). La concentración plasmática normal de amoníaco está en el rango de 10-35 μM, sin embargo, cuando la producción de amoníaco es excesiva, el amoníaco transportado por la sangre portal puede eludir el hígado dando lugar a la hiperamonemia . El amoníaco en la sangre atraviesa libremente la barrera hematoencefálica y los niveles elevados (>100 μM) tienen efectos tóxicos en el sistema nervioso central que conducen a la encefalopatía y, finalmente, al coma. Los pacientes con cirrosis hepática desarrollan con mucha frecuencia encefalopatía hepática (HE). En ausencia de insuficiencia hepática, el coma hiperamonémico se ha atribuido a la sepsis por microorganismos capaces de producir ureasa, como la Klebsiella pneumonia. Los enfoques terapéuticos clásicos para la ES implican la reducción de los niveles de amoníaco sistémico mediante el tratamiento con antibióticos (para eliminar las bacterias productoras de amoníaco intestinales) y la administración de azúcares no absorbibles, como la lactulosa y el lactitol . En el intestino grueso, la lactulosa se descompone por la acción de las bacterias colónicas principalmente en ácido láctico, y también en pequeñas cantidades de ácido fórmico y acético . Esta acidificación favorece la formación del ion amonio no absorbible a partir del amoníaco y reduce su concentración en el plasma. No está claro en qué medida el nitrato de la dieta contribuye a la concentración de amoníaco en el intestino y en la sangre, sin embargo, sugerimos la hipótesis alternativa de que el aumento de la acidificación del contenido colónico debido a la presencia de lactulosa favorece la conversión por parte de la microbiota de nitrito a NO en lugar de amoníaco por el conocido mecanismo dependiente del ácido.

Conclusiones

Durante más de 30 años el destino biológico del nitrato exógeno no ha podido ser contabilizado en los compuestos excretados que contienen nitrógeno y que suponen aproximadamente el 60% de una dosis de nitrato ingerida en humanos. Nuestros resultados apoyan la idea de que el nitrato se convierte en nitrito y luego en otras biomoléculas de nitrógeno reducidas, como el NO, el amoníaco, la urea y posiblemente el gas nitrógeno, por parte de las bacterias de la saliva, el estómago y el intestino delgado y grueso. Cuestiones como la cantidad de amoníaco que se genera a partir de la reducción de nitrato-nitrito frente a otros procesos importantes, como la desaminación y la actividad de las ureasas bacterianas, exigen estudios metabólicos detallados en animales y/o humanos. La importancia biológica de la conversión de los nitratos de la dieta en el lumen intestinal aún no se ha establecido. No obstante, las dietas tradicionales japonesa y mediterránea, de las que se sabe que tienen efectos protectores cardiovasculares, tienen una ingesta media de nitrato por persona de 2 a 3 veces superior a la dieta occidental típica (en Estados Unidos corresponde a unos 40-100 mg/día de nitrato). Es necesario seguir investigando la relación entre las bacterias simbióticas, el metabolismo de los óxidos de nitrógeno y la salud humana; sin embargo, está claro que las vías biológicas del metabolismo del nitrógeno en los mamíferos son más complejas y más importantes de lo que se imaginaba incluso hace unos años.