RESULTADOS Y DISCUSIÓN
Una línea celular de melanoma A375 con una MAPK constitutivamente activada debido a una mutación BRAFV600E fue tratada con el inhibidor de MEK U0126 a una concentración de 25 μM durante 8 h, lo que provocó la supresión de la fosforilación de ERK (Fig. 1 a). Los ARNm de los factores solubles inmunosupresores, incluidos la IL-6, la IL-10 y el VEGF, disminuyeron significativamente con el tratamiento con U0126 (Fig. 1 b), mientras que el tratamiento de control con DMSO no afectó a la producción de los ARNm de la IL-10 y el VEGF, y sólo aumentó ligeramente el nivel de ARNm de la IL-6. Una exposición de 18 horas al U0126 también suprimió la producción de IL-10, VEGF e IL-6 a nivel de proteínas, lo que indica que las ERK activadas pueden ser responsables de la supresión de las respuestas inmunitarias locales contra el melanoma mediante la producción de estos factores inmunosupresores (Fig. 1 c). Además, la supresión de la fosforilación de ERK y la inhibición de la producción de IL-6, IL-10 y VEGF se produjo incluso después de reducir la concentración del tratamiento con U0126 a 10 μM (no representado). Durante este estudio, no se observaron efectos citotóxicos significativos con el tratamiento con U0126 de las células A375. Aunque se sabe que el U0126 inhibe MEK5 además de MEK1/2, no se detectó la fosforilación de ERK5, el sustrato de MEK5, en las células A375 (no representado), lo que indica que la vía MEK1/2-ERK1/2 es responsable de los efectos observados con el tratamiento U0126. Los efectos supresores del U0126 sobre la producción de IL-10 y VEGF también se demostraron en otras tres líneas celulares de melanoma con la mutación BRAFV600E, 624mel, 888mel y 928mel, sin ninguna toxicidad celular significativa (Fig. 1 d). Dado que estas líneas celulares de melanoma no producen IL-6, la señalización MAPK activada parece tener un papel general en la producción de los factores inmunosupresores IL-10 y VEGF en las líneas celulares de melanoma BRAFV600E+.
Disminución de la producción de factores solubles inmunosupresores IL-6, IL-10 y VEGF de líneas celulares de melanoma con MAPK constitutivamente activa a través de la mutación BRAFV600E mediante la inhibición de la señalización de MAPK con un inhibidor de MEK, U0126. (a) La inhibición de la fosforilación de ERK1/2 se detectó mediante análisis de Western blot de la línea celular de melanoma A375mel con la mutación BRAFV600E antes y 2, 4, 6 y 8 h después del tratamiento con el inhibidor de MEK U0126 a una concentración de 25 μM. (b) Inhibición de la expresión del ARNm de los factores solubles inmunosupresores IL-6, IL-10 y VEGF en las células A375. Los ARNm de varios factores solubles, incluidos IL-6, IL-10 y VEGF, se midieron mediante RT-PCR cuantitativa antes y 2, 4, 6 y 8 h después del tratamiento con U0126. El tratamiento de control se realizó con una solución de DMSO. Los niveles de ARNm en cada punto de tiempo se normalizaron con respecto al ARNm de GAPDH y se indicaron como valor relativo al de 0 h. (c) Disminución de la producción de las proteínas IL-6, IL-10 y VEGF de las células A375 tras un tratamiento de 18 h con U0126 a una concentración de 25 μM. La expresión se detectó por ELISA con los sobrenadantes del cultivo. La relación entre la viabilidad de las células tratadas con U0126 y las tratadas con DMSO en la cosecha fue del 77%. La producción de citoquinas se normalizó con el valor de las células de control tratadas con DMSO en función del recuento de células. El Western blot mostró una fuerte inhibición de la fosforilación de ERK, pero no de la proteína STAT3, ni de su fosforilación en Ser727 y Tyr705. (d) Disminución de la producción de IL-10 y VEGF de tres líneas celulares de melanoma con la mutación BRAFV600E, 624mel, 888mel y 928mel tras un tratamiento de 18 horas con U0126 a una concentración de 25 μM, que se detectó mediante ELISA con los sobrenadantes del cultivo. Los ratios de viabilidad de las células tratadas con U0126 y con DMSO en el momento de la cosecha fueron del 95% para 624mel, del 103% para 888mel y del 100% para 928mel. La producción de citoquinas se normalizó con respecto al valor de las células de control tratadas con DMSO en función del recuento de células. El Western blot mostró una fuerte inhibición de la fosforilación de ERK, pero no de la proteína STAT3. Se observó una ligera disminución de la fosforilación en Ser727 de STAT3 en las células 888mel y 928mel, pero no en las células 624mel. Estos resultados son representativos de tres o cuatro experimentos independientes con resultados similares.
Sin embargo, los efectos no específicos de U0126 sobre la producción de citoquinas a través de vías distintas de la señalización MAPK no pueden descartarse completamente a partir de estos experimentos debido a la ligera disminución observada en la fosforilación de STAT3 en Ser727 en 888mel y 928mel (Fig. 1 d). Para confirmar el papel de la MAPK activada debido a la mutación BRAFV600E en la producción de IL-10, VEGF e IL-6, se transfectó ARNi específico de BRAFV600E en tres líneas celulares de melanoma, A375, 888mel y 624mel, utilizando el lentivirus que expresa ARN de horquilla corta (ARNhc) específico de BRAFV600E (11). El ARNi específico de BRAFV600E inhibió significativamente la producción de IL-10, VEGF e IL-6 y suprimió la fosforilación de ERK (Fig. 2). Estos resultados confirman que la inhibición de estos factores por el U0126 (Fig. 1) está correlacionada con la inhibición específica de la vía MAPK. Estos resultados son coherentes con trabajos recientes que muestran la producción de IL-10 inducida por ERK1/2 en macrófagos murinos (12) y la producción de VEGF dependiente de BRAFV600E para la promoción de la angiogénesis (13).
Disminución de la producción de los factores inmunosupresores IL-6, IL-10 y VEGF de tres líneas celulares de melanoma con la mutación BRAFV600E mediante ARNi específico de BRAFV600E. Las tres líneas celulares de melanoma con la mutación BRAFV600E, A375mel, 888mel y 624mel, se infectaron con los vectores lentivirus que codifican ARN de horquilla corta para el ARNm de la luciferasa de luciérnaga (GL3B; como control) o el ARNm de BRAFV600E (BRAF#1′) con una multiplicidad de infección de 50 o 100. A los 5 o 6 d de la infección, se extrajeron las proteínas y se sometieron a un análisis de Western blot. Se observó una profunda disminución de la fosforilación de ERK1/2 con la disminución de la proteína BRAF mediante el ARNi específico de BRAFV600E. No se observó ninguna diferencia significativa en la proteína STAT3 ni en la fosforilación de STAT3 en Ser727 o Tyr705. Se observó una ligera disminución de la fosforilación en Ser727 en las células 888mel y 624mel tras el ARNi de BRAF. 5 ó 6 d después de la infección con lentivirus, se dispensó un número igual de células de melanoma a una densidad de 1-2 × 106 células/2 ml, y los sobrenadantes de cultivo después de 18 h se sometieron a ELISA para IL-6, IL-10 o VEGF. Se observó una profunda disminución de la IL-6, la IL-10 y el VEGF. Se muestra un resultado representativo de dos o tres experimentos independientes con resultados similares.
Debido a que se ha determinado que la señalización STAT3 activada da lugar a la evasión inmunitaria del cáncer a través de la producción de varios factores, incluido el VEGF (8, 9), investigamos la relación entre las vías MAPK y STAT3 en lo que respecta a la producción de factores inmunosupresores en la línea celular de melanoma A375. La producción de IL-6, IL-10 y VEGF fue profundamente inhibida por el ARNi dirigido a BRAFV600E solo o a STAT3 solo (Fig. 3 a). No se observó ningún efecto aditivo o sinérgico claro al restringir simultáneamente las vías BRAF-MAPK y STAT3 (Fig. 3 a). El ARNi de BRAFV600E en las células A375 no disminuyó la actividad de unión al ADN de STAT3 (Fig. 3 b), la actividad promotora de STAT3 (Fig. 3 c) ni la fosforilación de STAT3 en Ser727 o Tyr705 (Fig. 2), aunque se ha informado de que las ERK son potencialmente capaces de fosforilar STAT3 en Ser727 (14). Sin embargo, la fosforilación de STAT3 también puede producirse por una vía independiente de las ERK (15). En las células 624mel, aunque hubo una ligera disminución de STAT3 fosforilada en Ser727, la actividad de unión al ADN (Fig. 3 b) y la actividad promotora de STAT3 (Fig. 3 c) no se vieron afectadas por el ARNi de BRAFV600E (Fig. 2). En las células 888mel, se produjo una disminución similar de la fosforilación en Ser727, pero, por el contrario, tanto la actividad de unión al ADN de STAT3 (Fig. 3 b) como la actividad promotora de STAT3 (Fig. 3 c) disminuyeron tras el ARNi de BRAFV600E (Fig. 2). Estos resultados sugieren que la reducción de la actividad de transcripción de STAT3 no es el principal mecanismo que genera la supresión del factor inmunosupresor mediante la regulación a la baja de la señalización de MAPK en estas líneas celulares de melanoma.
Inhibición de la producción de IL-6, IL-10 y VEGF en las células A375 mediante el RNAi para BRAFV600E solo, STAT3 solo o ambos, sin cambios significativos en la actividad de unión al ADN y promotora de STAT3. (a) Inhibición profunda de la producción de IL-6, IL-10 y VEGF en A375 mediante el ARNi para BRAFV600E solo, STAT3 solo o ambos. 5 ó 6 d después de la infección, se dispensó un número igual de células a una densidad de 106 células/2 ml, y el sobrenadante del cultivo después de 18 h se sometió a ELISA para IL-6, VEGF e IL-10. La disminución de BRAF y de ERK1/2 fosforilada por el ARNi específico de BRAFV600E y la disminución de STAT3 por el ARNi específico de STAT3 se confirmaron mediante análisis de Western blot. Se muestra un resultado representativo de seis experimentos independientes con resultados similares. (b) No hay cambios significativos en la actividad de unión al ADN de STAT3 por la inhibición de la señalización de MAPK con ARNi de BRAF en líneas celulares de melanoma. La actividad de unión al ADN de STAT3 se examinó mediante EMSA de los extractos nucleares de las líneas celulares de melanoma con el control GL3B o el tratamiento con el vector BRAF#1′ shRNA. Las bandas específicas de STAT3 indicadas con flechas desaparecieron con la sonda de ADN de STAT3 de tipo salvaje (wt) en frío, pero no con la sonda de ADN de STAT3 mutante (mt). Sólo se observó una ligera disminución de la actividad de unión al ADN de STAT3 en las células 888mel. (c) Ensayos de reportero STAT3 en células A375, 624mel y 888mel. Se transfectaron 2-4 × 105 células con la infección del vector BRAF#1′ o de control con 0,4 μg de pSTAT3-TA-Luc y 0,4 μg de pRL-SV40 con el reactivo de transfección Effectene. 24 h después de la transfección, se cosecharon las células y se analizó la actividad de luciferasa de luciérnaga y renilla. Cada actividad de luciferasa de luciérnaga se normalizó con la actividad de luciferasa de renilla. Las barras sombreadas y las barras de error indican la media y la desviación estándar de los ensayos por triplicado, respectivamente. Se muestra un experimento representativo de tres o cuatro experimentos independientes. La transcripción impulsada por STAT3 no se modificó tras el ARNi de BRAF en A375 y 624mel, pero disminuyó ligeramente en 888mel.
A continuación, se investigaron los posibles efectos causados por los factores solubles inducidos por la señalización de MAPK y STAT3 en el sobrenadante de los cultivos de A375 sobre la maduración de las DC. El sobrenadante de los cultivos de células de melanoma A375 contiene factores solubles que inhiben la maduración de las DC humanas derivadas de monocitos (MoDC) cuando se las estimula con ligandos del receptor tipo Toll, como el LPS. La adición de los sobrenadantes del cultivo de A375 a los cultivos de MoDC a una concentración final del 10-20% disminuyó significativamente la producción de citoquinas inflamatorias, incluidas la IL-12 y el TNF-α, en los MoDC, así como las moléculas de superficie celular CD1a y CD83, pero no CD80, CD86, CD40 o HLA-DR en los MoDC. Los sobrenadantes de las otras tres líneas celulares de melanoma produjeron los mismos resultados cuando se añadieron a los cultivos de MoDC (no representados). La actividad supresora de los sobrenadantes de células de melanoma se debe a la producción de IL-6, IL-10 y VEGF, ya que la adición de anticuerpos específicos para estos factores redujo la actividad supresora de los sobrenadantes del cultivo de A375 (Fig. 4 a). Las disparidades entre nuestras observaciones y los resultados previamente comunicados sobre el sobrenadante de células de melanoma B16 murino con un STAT3 activado que inhibe la expresión de MHC clase II y CD40 pueden explicarse por las diferentes células tumorales o especies (8).
Disminución de la actividad supresora de los sobrenadantes de cultivo de melanoma A375 mediante el pretratamiento con RNAi para BRAFV600E solo, STAT3 solo, o ambos sobre la producción de IL-12 y TNF-α inducida por LPS de las DCs. (a) La neutralización de IL-6, IL-10 o VEGF en los sobrenadantes de cultivo de las células de melanoma A375 restableció la inhibición de la producción de IL-12 de las DC humanas estimuladas por LPS. Las MoDC humanas se cultivaron con los sobrenadantes de A375 en presencia o ausencia del anticuerpo monoclonal para IL-6, IL-10, VEGF o un anticuerpo de control del isotipo a 1 μg/ml. La producción de IL-12 en los sobrenadantes de cultivo se determinó por ELISA 24 h después de la estimulación con LPS a 100 ng/ml. (b) Los monocitos CD14+ se aislaron de las PBMC mediante MACS y se cultivaron en medios que contenían RPMI 1640, 10% (vol/vol) de FBS, 100 ng/ml de GM-CSF y 50 ng/ml de IL-4 con o sin 20% (vol/vol) del sobrenadante de cultivo de las células A375mel preparadas en la Fig. 3. (a) La mitad de los medios, las citocinas y el sobrenadante de cultivo se cambiaron cada 2 d. El día 5 del cultivo, se añadió LPS a 100 ng/ml. Después de 15 horas, se recogieron los sobrenadantes de cultivo y se sometieron a ELISA de IL-12 y TNF-α.
La actividad supresora de los sobrenadantes de cultivo de A375 sobre la producción de IL-12 y TNF-α de las MoDCs tratadas con LPS se restableció pretratando las células A375 con RNAi dirigido sólo a BRAFV600E, sólo a STAT3, o tanto a BRAFV600E como a STAT3 (Fig. 4 b). Aunque el ARNi de STAT3 pareció reducir la actividad supresora de los sobrenadantes de cultivo de A375 más que el ARNi de BRAFV600E, la diferencia puede deberse simplemente a las diferentes actividades del ARNi. Sin embargo, es importante señalar que no se observaron efectos aditivos y sinérgicos por parte del ARNi dirigido simultáneamente a BRAF y STAT3, lo que indica una vez más el papel esencial de ambas vías de señalización en la producción de factores supresivos en la maduración de las DC. Aunque se ha informado de la activación de las DC por el sobrenadante de la línea celular murina de cáncer de colon CT26 transfectada con una forma dominante-negativa de STAT3, posiblemente a través del aumento de la producción de citoquinas proinflamatorias, en este estudio no se observó la activación de las DC. Esto puede explicarse por una inhibición incompleta de BRAF y STAT3, por la ausencia de un aumento de la producción de citoquinas proinflamatorias en las células de melanoma transfectadas con ARNhc de BRAF, o por diferencias en las células tumorales o en las especies.
En resumen, hemos demostrado por primera vez un papel esencial de la señalización de MAPK junto con la vía de STAT3 en la producción de varios factores inmunosupresores en líneas celulares de melanoma con MAPK constitutivamente activa debido a la mutación común BRAFV600E. Así pues, la vía MAPK puede ser una diana molecular potencialmente importante para superar la evasión inmunitaria de varios cánceres, ya que se activa con frecuencia en varios tipos de cáncer, incluido el melanoma sin la mutación BRAFV600E (16, 17).