El objetivo general de este procedimiento es extraer secuencialmente ARN y ADN de núcleos de tejido fijados en formol e incluidos en parafina. Este es un protocolo para cosechar núcleos de tejido de los que extraeremos tanto el ARN como el ADN. La principal ventaja de este protocolo es que mejora los rendimientos de ARN y ADN a partir de regiones precisamente seleccionadas en el bloque de tejido.

Este procedimiento se ha desarrollado en gran medida en tejidos de cáncer de próstata de archivo. También puede aplicarse a otros tipos de tejidos de archivo. La demostración visual de este método es fundamental, ya que los pasos de extracción de núcleos de tejido no se utilizan habitualmente en los laboratorios de investigación.

La mayoría de los laboratorios de investigación utilizan en su lugar secciones transversales, que agotan los tejidos más rápidamente y añaden una importante heterogeneidad a la muestra. Comience revisando el portaobjetos del microscopio y delineando la región de interés con un marcador permanente de punta fina. A continuación, corte una sección de película de parafina lo suficientemente grande como para cubrir la región de interés en el portaobjetos.

A continuación, coloque la película firmemente en el portaobjetos, envolviendo la película sobre los bordes para evitar que se deslice. Con un rotulador permanente de punta fina, perfile todo el tejido y la región de interés dentro del tejido. A continuación, retire la película del portaobjetos y transfiérala al bloque de tejido correspondiente.

Oriente la película dándole la vuelta o girándola para que el contorno de todo el tejido coincida con la forma observada del tejido en el bloque. Presione la sección de la película firmemente contra la superficie del bloque para evitar que se deslice. Con la punta del rotulador permanente, haga hendiduras poco profundas pero visibles a lo largo del contorno de la región de interés y, a continuación, retire la película.

A continuación, limpie el punzón receptor del juego de punzones de 0,6 milímetros sumergiendo la punta en el tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitros que contiene un mililitro de lejía y deslizando el punzón hacia arriba y hacia abajo varias veces. Repita el lavado con el tubo que contiene un 70% de etanol y luego agua. Ahora presione el punzón limpio en la región de interés hasta una profundidad de tres milímetros y retírelo.

Suelte el núcleo en un tubo de microcentrífuga de baja adhesión empujándolo fuera del punzón con el estilete. Añadir un mililitro de xileno a los tubos de microcentrífuga que contienen los núcleos de tejido y agitar enérgicamente durante diez segundos. A continuación, colóquelos en un bloque térmico ajustado a 50 grados Celsius durante tres minutos.

Después de la incubación, centrifugue durante dos minutos a temperatura ambiente a la máxima velocidad. Después de la centrifugación, coloque los núcleos en hielo durante cinco minutos para solidificar el residuo de cera. Ahora, retire con cuidado la parafina que se ha acumulado alrededor del menisco junto con el sobrenadante utilizando una punta de pipeta.

A continuación, repita el tratamiento con xileno. Tras retirar la mezcla de parafina y xileno, añadir un mililitro de etanol al 100 por ciento y agitar enérgicamente durante diez segundos. Después de centrifugar a máxima velocidad durante dos minutos, deseche cuidadosamente el etanol.

Repita el lavado con etanol una vez más antes de comenzar la homogeneización. Resuspenda los núcleos desparafinados en 700 microlitros de etanol al 100% antes de la homogeneización. Utilice un homogeneizador de tejidos motorizado en un ajuste medio para moler los núcleos hasta convertirlos en partículas finas.

Se requiere una homogeneización completa de los núcleos de tejido para obtener un rendimiento óptimo de ADN y ARN. A continuación, llene tubos separados de 15 mililitros con aproximadamente diez mililitros de lejía, solución neutralizadora de RNasa y etanol al 70%. Después de la homogeneización de la muestra, lave la sonda del homogeneizador en cada una de las soluciones de limpieza en orden.

Haga funcionar el homogeneizador a la velocidad más alta durante la etapa de lavado. Limpie la sonda con un pañuelo de papel y deje que se seque completamente antes de homogeneizar la siguiente muestra. Inspeccione visualmente las hojas de la sonda para ver si hay trozos de tejido residuales y, si los encuentra, limpie la sonda de nuevo.

Después de la homogeneización, lleve el volumen de la muestra a un mililitro con etanol al 100 por ciento y, a continuación, centrifugue a velocidad máxima durante 15 minutos. Aspirar cuidadosamente el etanol y secar al aire los pellets durante aproximadamente 15 a 20 minutos antes de comenzar la extracción con proteinasa K. Resuspender los pellets en 150 microlitros de tampón de digestión de proteinasa K y agitar los tubos para aflojar el pellet.

Se recomienda la digestión de proteinasa K durante la noche para una mayor recuperación de ADN. Añada 10 microlitros de proteinasa K estable a la temperatura y mezcle sacudiendo. Incubar a 56 grados Celsius durante 15 minutos con agitación suave.

Incubrir los tubos en hielo durante tres minutos. Tras el enfriamiento, centrifugar el tubo durante 15 minutos a velocidad máxima. A continuación, sin perturbar los pellets, transfiera cuidadosamente cada sobrenadante a un nuevo tubo de microcentrífuga para la purificación del ARN.

Extraiga el ARN y el ADN utilizando el procedimiento optimizado en el protocolo escrito, que incluye un tiempo de digestión del tejido prolongado para la extracción del ADN. El ARN y el ADN pueden recuperarse de muestras de tejido más antiguas fijadas en formol e incluidas en parafina utilizando este método. Se coextrajeron ácidos nucleicos de muestras de cáncer de próstata con una antigüedad de entre tres y 14 años.

El rendimiento medio fue de 2, 270 nanogramos de ARN y 820 nanogramos de ADN. Curiosamente, no hubo una correlación significativa entre la edad de la muestra de tejido y la recuperación de ácido nucleico. En general, los rendimientos de ARN y ADN estaban correlacionados en todas las muestras, aunque en la mayoría de los casos se recuperó más del doble de ARN en relación con el ADN.

Para demostrar el rendimiento del ADN genómico extraído con este protocolo, se amplificaron extractos de ADN convertidos en bisulfito de muestras de cáncer de próstata de archivo mediante PCR específica de metilación. Los elementos repetitivos ALU se utilizaron como control de metilación y mostraron poca variación entre las muestras. GSTP1, un gen conocido por estar hipermetilado en el cáncer de próstata, no mostró una amplificación detectable por PCR específica de metilación cuando se utilizó ADN extraído de muestras benignas.

Las muestras de ADN de pacientes con cáncer de próstata agresivo mostraron valores de umbral de ciclo de QPCR detectables que fueron inferiores a los de las células de cáncer de próstata indolente, lo que indica una mayor metilación de GSTP1 en el cáncer de próstata agresivo. Una vez dominada, esta técnica puede realizarse en tres o cuatro horas para el ARN, y tras la digestión nocturna, en cuatro horas para el ADN si se realiza correctamente. Esta técnica debería permitir a los investigadores en patología molecular explorar biomarcadores de ADN y ARN de diagnóstico en una variedad de cánceres.

Después de ver este vídeo, debería tener una buena comprensión de cómo preparar núcleos de tejido para la extracción de ADN y ARN de áreas de interés mapeadas con precisión en bloques de tejido de archivo.