Las soluciones tampón de acetato de amonio pueden causar varios problemas en el laboratorio. Dos problemas comunes son los aumentos sorprendentes de las contrapresiones de HPLC-MS al poner en marcha el instrumento después de un almacenamiento nocturno y las dificultades con la sensibilidad de la MS.
El aumento de la contrapresión del instrumento cuando se utiliza acetato de amonio (y formiato de amonio) es un problema común que se encuentra en los foros de cromatografía, especialmente cuando el instrumento estuvo parado durante la noche o en las primeras pasadas de cada día. Los tampones acuosos de alta solubilidad pueden dar mucho juego. Se convierten en un problema en el uso práctico, ya que bloquean los capilares, las precolumnas y las fritas de los extremos de las columnas analíticas.
Estos problemas resultan invariablemente de un mal entendimiento de la solubilidad de los tampones en medios acuosos orgánicos mixtos. Esto puede superarse utilizando los datos mostrados en la Figura 1.
Figura 1: Solubilidad de cinco tampones en mezclas con acetonitrilo. (Adaptado con permiso de la Ref. 1)
La Figura 1 muestra claramente que la solubilidad del acetato de amonio en mezclas binarias que contienen más del 90% de acetonitrilo es cada vez más limitada en solubilidad, y totalmente insoluble en el 100% de acetonitrilo. Mientras que 20mM de acetato de amonio es el límite de solubilidad al 90% de acetonitrilo, este límite cae bruscamente a 10mM de acetato de amonio (una concentración de tampón popular utilizada con aplicaciones LC-MS) en mezclas al 95% de acetonitrilo. Si se superan estos límites de solubilidad, se produce un líquido turbio debido al fino precipitado de acetato de amonio en la solución. Esto puede bloquear los capilares y las fritas de la columna, provocando un aumento de la contrapresión del sistema. También debe tenerse en cuenta que los datos de la Figura 1 se obtienen utilizando un tampón de alta calidad; la solubilidad disminuirá si se utilizan reactivos de sal de tampón de menor calidad (pureza). Evite intentar disolver el acetato de amonio en acetonitrilo puro, aunque a la solución se le añada agua. Aunque en un principio pueda parecer que el tampón es soluble, se desprenderá rápidamente de la solución (Figura 2).
Figura 2: Residuo de acetato de amonio creado al “disolver” el acetato de amonio en acetonitrilo, seguido de la adición de agua para lograr la proporción orgánica/acuosa requerida del eluyente (Fotografía cortesía del Dr. Paul Ferguson, Astra Zeneca, Reino Unido).
En un gradiente típico de HPLC de fase inversa, esto quizás no sea un gran problema, a menos, por supuesto, que su gradiente llegue al >90% de acetonitrilo. Sin embargo, hay otras consideraciones, como los porcentajes relativos de disolvente orgánico que puede encontrar el tampón acuoso cuando se mezclan utilizando sistemas de mezcla de baja o alta presión, cuando se inyectan muestras disueltas en altos porcentajes de acetonitrilo o, en el peor de los casos, cuando los sistemas se lavan con acetonitrilo al 100% para eliminar los contaminantes de la columna o para el almacenamiento nocturno.
También hay que tener en cuenta, cuando se utiliza acetonitrilo al 100% para el almacenamiento de la columna, que pueden producirse grandes cambios de pH en el disolvente orgánico al 100% y hay que tener en cuenta si estos cambios de pH pueden llevar el pH de almacenamiento de la columna a un rango en el que sea posible la disolución de la matriz de sílice, lo que llevaría a la formación de “finos” dentro de la columna que, en última instancia, daría lugar a bloqueos de la columna (a un pH alto) o a la eliminación de los ligandos de la fase enlazada (a un pH bajo).
Acetato de amonio como tampón
Muchos optan por utilizar acetato de amonio como tampón, especialmente cuando se utiliza la detección por EM, debido a su volatilidad inherente y su baja propensión a la contaminación de la fuente de API. Sin embargo, hay que tener en cuenta esta solubilidad limitada y ajustar nuestra práctica de HPLC en consecuencia. Comprender si el uso de acetato de amonio es apropiado para el experimento y si realmente es necesario un tampón. Los requisitos de uso y la elección y concentración adecuadas de un tampón suelen ser malinterpretados. El acetato de amonio es el caso que nos ocupa para investigar los usos y abusos de este sistema tampón tan apreciado.
Los tampones son necesarios para resistir pequeños cambios de pH (principalmente del eluyente) y para garantizar que la columna de HPLC permanezca en un estado de carga constante (principalmente el estado de ionización de las especies de silanol residuales en la superficie del soporte de sílice). Los cambios en el pH pueden causar problemas con la estabilidad del tiempo de retención, la forma de los picos y (cuando se utiliza la EM de Electrospray) la sensibilidad del instrumento. Normalmente, el mayor “desafío” para el pH del sistema vendrá de la mezcla del diluyente de la muestra con el eluyente en los componentes conectivos entre el inyector y la columna de HPLC (o precolumna) y en la cabeza de la columna. Si el diluyente de la muestra tiene un pH diferente, entonces el analito (o una parte de las moléculas del analito) puede cambiar de estado de ionización y cromatografiar de forma diferente o responder de forma diferente en la interfaz de EM como resultado. Sin embargo, es importante comprender la química de nuestro método analítico para tomar decisiones críticas sobre el tipo y la concentración del tampón. Las concentraciones de analitos y la cantidad de superficie de la columna que requieren control de pH son lo suficientemente bajas como para necesitar sólo una concentración muy baja de tampón para mantener tiempos de retención reproducibles, una forma de pico aceptable y sensibilidad de detección.
La figura 3 indica las situaciones en las que el acetato de amonio puede ser de utilidad tanto en cromatografía como en espectrometría de masas.
Figura 3: Variación de la capacidad tampón para una solución acuosa de acetato de amonio (10mM) con varias proporciones de acetonitrilo (%) (Adaptado con permiso de la Ref. 2)
Esencialmente, hay dos regiones de amortiguación cuando se añade acetato de amonio 10mM a nuestra solución eluyente, y se utiliza amoníaco diluido o ácido fórmico para ajustar el pH. Sin la adición del ácido o la base, la solución tendrá muy poca capacidad tampón.
En una solución 100% acuosa, los valores pKa del tampón se sitúan en torno a 4,8 y 9,5. El tampón se utiliza mejor alrededor de +/- 1 unidad de pH del pKa del tampón, donde la capacidad tampón se reducirá a alrededor del 66%. A 2 unidades de pH del pKa del tampón, la capacidad tampón se reduce a alrededor del 5%. Para un tampón de acetato de amonio en agua, el pH del eluyente utilizado para la separación debe ser de 3,8 a 5,8 cuando se utiliza ácido fórmico como modificador del pH y de 8,5 a 10,5 cuando se utiliza amoníaco para ajustar el pH del eluyente. La advertencia: una vez que se añade acetonitrilo al sistema, este rango de trabajo cambia y el rango de pH utilizable pasa a ser de 5,2 a 7,2 o de 7,9 a 9,9 con un 60% de acetonitrilo. En las separaciones por gradiente, el pKa del sistema tampón cambiará constantemente. El pKa del sistema en la composición inicial del gradiente se utiliza para estimar la utilidad del tampón para la separación.
¿Serán estos rangos de pH suficientes para evitar cambios en el grado de ionización del analito o cambios de protonación de la columna? Esa es la pregunta clave.
Para la detección por EM, los analitos ionogénicos en la forma ionizada darán lugar a una buena sensibilidad de detección, al tiempo que se gestiona la retención en fase inversa mediante la elección juiciosa de la fase estacionaria y el tipo y composición del disolvente orgánico. Si el analito está totalmente ionizado en los rangos de pH sugeridos anteriormente (y en la Figura 3), se obtendrá un buen rendimiento cromatográfico y de detección. Obsérvese en la figura 1 que la capacidad tampón del sistema se reduce a medida que se añade acetonitrilo, y que la capacidad tampón cae al 30% del valor acuoso al 60% de acetonitrilo. El principio clave del uso de tampón en LC-MS es utilizar la menor cantidad posible para mantener la reproducibilidad del tiempo de retención, una forma de pico aceptable y la sensibilidad del detector. La concentración de tampón influirá directamente en la cantidad de supresión de iones encontrada y, por tanto, la sensibilidad del método se verá directamente afectada. Para mantener una buena capacidad de amortiguación en concentraciones de tampón más bajas, a menudo intentamos trabajar dentro de +/- 0,5 unidades del pKa del tampón.
La tabla 1 muestra los rangos de pH recomendados en los que los tampones de acetato de amonio serán útiles.
| % MeCN | Rango de capacidad máxima de los tampones (ácido acético / acetato) | Rango de capacidad máxima de los tampones (amonio / amoníaco) | Capacidad de los tampones (% respecto a la solución 100% Aq) |
| 0 | 4.2 – 5.2 | 9.0 – 10.0 | 100 |
| 20 | 4.7 – 5.7 | 8.7 – 9.7 | 80 |
| 40 | 5.0 – 6,0 | 8,5 – 9,5 | 50 |
| 60 | 5,6 – 6,6 | 8,3 – 9,3 | 30 |
Tabla 1: Rangos de trabajo de pH recomendados y capacidades tampón relativas indicativas para sistemas de eluyente de acetato de amonio (aq) / acetonitrilo 0,1mM.
Utilice los rangos de tampón de la Tabla 1 para seleccionar el pH del eluyente en el que el analito debe ser ionizado al 100%. Tenga en cuenta que la concentración de tampón utilizada para derivar estas cifras es de 0,1 mM, una elección popular para la concentración de tampón cuando se utiliza la detección por EM. En el caso de los analitos básicos, el sistema de amortiguación de ácido acético/acetato es habitual, y el pH del eluyente suele estar muy por debajo del pKa de los analitos básicos, lo que garantiza su protonación constante. Lo mismo puede ocurrir con los analitos ácidos con el sistema de amonio/amoniaco, donde los analitos ácidos deben estar totalmente desprotonados. Esto garantizará que los tiempos de retención sean constantes, que las formas de los picos sean saludables y que la sensibilidad de la EM se optimice desde la perspectiva de la química del método.
Hay grandes lagunas en los rangos de amortiguación efectivos para los eluyentes basados en acetato de amonio. Es decir, con una composición de eluyente del 20% de acetrontrilo (o una composición de gradiente inicial del 20% de acetonitrilo), es probable que haya una menor capacidad de amortiguación (será necesario utilizar mayores concentraciones de tampón) con un pH de eluyente inferior a 4,2, entre pH 5,2 y 9,0 o superior a 10,0. Hay otros métodos en los que el pH del eluyente se ajusta fuera de estos rangos recomendados cuando se utilizan tampones de acetato de amonio. Considere la posibilidad de utilizar un sistema tampón diferente -el sistema de ácido fórmico/formato es una opción popular en valores de pH del eluyente inferiores a 4,2.
¿Debe utilizarse siempre un tampón?
Si el pH del eluyente está lejos del pKa del analito, los pequeños cambios en el pH del eluyente tendrán un efecto insignificante en el grado de ionización del analito. En estas circunstancias, el uso de un tampón puede ser innecesario. Por ejemplo, el ácido acético (así como el fórmico, el trifluoro y el difluoroacético) tiene una importante capacidad de “autoamortiguación” a bajo pH, y proporciona al analito básico un pKa >2 unidades de pH más alto y al analito ácido un pKa
Todo esto suponiendo que los analitos básicos se analicen utilizando un sistema de eluyente ácido y los analitos ácidos con un sistema de eluyente de pH más básico para garantizar una ionización completa y una buena sensibilidad de la EM por electrospray. Si se experimentan problemas con la contrapresión del instrumento, la inestabilidad del tiempo de retención o la sensibilidad de detección de la EM, entonces puede valer la pena considerar si se requiere una sal tampón. El uso juicioso de los ácidos fórmico o acético o de la solución de amoníaco puede resolver cualquier problema.
Sea cual sea el caso, tómese el tiempo necesario para comprender la química del método con respecto al pKa de su analito, el pH requerido del eluyente y la elección del sistema de amortiguación utilizado para alcanzar y mantener este pH dentro del sistema.
Para aquellos que no tienen información sobre el pKa del analito, hay varios programas gratuitos disponibles que hacen un trabajo razonable de predicción del pKa del analito basado en la estructura. Ampliamente utilizados en nuestros laboratorios son:
- ChemSketch – https://www.acdlabs.com/resources/freeware/chemsketch/
- MarvinSketch – https://chemaxon.com/products/marvin
Si busca una comprensión más profunda de los tampones y su uso dentro de HPLC y LC-MS, consulte los artículos en las referencias 3-6.
Solubility of Buffers in Aqueous-Organic Eluents for Reversed-Phase Liquid Chromatography, Adam P. Schellinger and Peter W. Carr, LCGC North America Volume 22 Number 6 June 2004
Buffer Considerations for LC and LC-MS, Xavier Subirats, Elisabeth Bosch, and Marti Rosés, LCGC North America Volume 27 Number 11 November 2009
Mobile-Phase Buffers, Part I – The Interpretation of pH in Partially Aqueous Mobile Phases, LCGC North America Volumen 20 Número 11 de noviembre de 2002
Tampón de fase móvil, Parte II – Selección de tampón y capacidad, LCGC North America Volumen 20 Número 12 de diciembre de 2002
Tampón de fase móvil, Parte III – Selección de tampón y capacidad, LCGC North America Volumen 21 Número 1 de enero de 2003
Tampón de fase móvil en LC: Effect of Buffer Preparation Method on Retention Repeatability, LCGC North America Volumen 37, número 7, julio de 2019