Implicación clínica

La inestabilidad de microsatélites (MSI) es el resultado de la acumulación sistemática de deleciones/inserciones en secuencias cortas y repetitivas de ADN en células tumorales con un sistema de reparación de desajustes (MMR) deficiente. La MSI se produce en aproximadamente el 15% de todos los cánceres colorrectales y es clínicamente útil para identificar a los pacientes con cáncer colorrectal hereditario sin poliposis (HNPCC, síndrome de Lynch) causado por mutaciones en la línea germinal de los genes MMR. El estado de la MSI también puede predecir la respuesta/resistencia del cáncer a ciertas quimioterapias.

En un intento de estandarizar el análisis de MSI, un taller del Instituto Nacional del Cáncer (NCI) de 1997 recomendó un panel de referencia de cinco marcadores de microsatélites para la detección de MSI y estableció directrices de clasificación de MSI basadas en los resultados. El panel de referencia, denominado panel Bethesda, consta de dos loci mononucleótidos (Big Adenine Tract o BAT-25 y BAT-26) y tres loci dinucleótidos (D2S123, D5S346 y D17S250). Utilizando el panel Bethesda, los cánceres con inestabilidad en 2 o más de estos loci se interpretaron como MSI-alto (MSI-H), y los cánceres sin inestabilidad en ninguno de los cinco loci se consideraron Microsatellite Stable (MSS). En otro taller de seguimiento del NCI, se reconoció que la sensibilidad y especificidad del panel original de Bethesda podría ser limitada debido a la inclusión de repeticiones de dinucleótidos, que son menos sensibles y específicas que las repeticiones de mononucleótidos para la identificación de cánceres con deficiencias de MSI. Se ha sugerido que un panel de repeticiones de mononucleótidos cuasimonomórficos, puede ser lo suficientemente sensible y específico para la detección de cánceres con MSI alto y puede obviar la necesidad de ADN normal coincidente para los tumores que se analizan (1-8).

Sistema de análisis de MSI (kit de uso exclusivo para investigación, versión 1.2, Promega Corporation).

El sistema de análisis de MSI es un ensayo múltiple basado en PCR fluorescente para la detección de inestabilidad de microsatélites. El sistema de análisis MSI incluye cebadores marcados con fluorescencia para la co-amplificación de cinco marcadores mononucleótidos repetidos cuasimonomórficos (BAT-25, BAT-26, NR-21, NR-24 y MONO-27). Los productos de la PCR se separan por electroforesis capilar (CE) utilizando un analizador genético Applied Biosystems 3500Dx. La inestabilidad de los microsatélites en 2 o más loci mononucleótidos se interpreta como MSI-alto; la inestabilidad de los microsatélites en un solo locus mononucleótido o la ausencia de inestabilidad en ninguno de los loci analizados se interpreta como microsatélite estable (MSS). Normalmente, las muestras con MSI alto muestran inestabilidad en todos los loci con una disminución media del tamaño del producto de 5 a 9 bases. La presencia de MSI se detecta con una especificidad analítica de al menos el 99% y un límite de detección de al menos el 5%.

Una característica importante del diseño del sistema de análisis MSI es el espaciado entre los cinco loci diferentes, que generalmente supera el número típico de bases desplazadas (una media de 5 a 9 bases) cuando hay MSI. El tamaño más largo del amplicón de PCR es de 154 pares de bases, lo que resulta ventajoso para el análisis de tejidos fijados en formol e incluidos en parafina (FFPE).

Este ensayo es el estándar para las pruebas rutinarias de MSI de alto rendimiento, especialmente cuando se solicitan otros ensayos moleculares posteriores en la misma muestra de ADN.

Requisitos del espécimen

Los especímenes aceptables para el ensayo son especímenes de tejido de carcinoma colorrectal fijados en formalina e incluidos en parafina con un tiempo de fijación de 6-48 horas.

Se prefiere un bloque de parafina representativo. Alternativamente, para las muestras de resección se requiere un mínimo de 5 secciones de tejido sin teñir (5 µm de grosor).

Instrucciones de almacenamiento y envío

Mantenga y envíe las muestras a temperatura ambiente.

Limitaciones

Es posible que un contenido tumoral insuficiente no permita la detección de la inestabilidad MSI: se requiere un 10% de células tumorales. El contenido tumoral se evalúa antes del análisis y se realiza una macrodisección. Los fijadores distintos del formol o un tiempo de fijación prolongado pueden dar lugar a resultados inadecuados.

Requisitos especiales

Ninguno.

Tiempo de entrega

De cinco a siete días hábiles para los portaobjetos y los bloques de parafina respectivamente.

2. IdyllaTM MSI Assay (CE-IVD) – Acreditación pendiente

El IdyllaTM MSI Assay (RUO) realiza la detección de la inestabilidad de los microsatélites directamente a partir de secciones de tejido de cáncer humano fijadas en formol e incluidas en parafina (FFPE) utilizando una reacción de PCR seguida de un análisis de curva de fusión de alta resolución en un instrumento IdyllaTM.

El ensayo realiza la detección de mutaciones en 7 loci homopolímeros monomórficos para la identificación de cánceres humanos con inestabilidad de microsatélites (ACVR2A, BTBD7, DIDO1, MRE11, RYR3, SEC31A y SULF2). Estos biomarcadores son específicos de cada tumor, muestran una alta frecuencia en los cánceres colorrectal y de endometrio y son estables en diferentes etnias. Además, estos biomarcadores específicos del tumor no requieren el análisis de muestras de tejido normal emparejadas.

El estado MSI de una muestra se determina con la llamada final de los 7 biomarcadores. La inestabilidad de los microsatélites en 2 o más loci mononucleótidos se interpreta como MSI-alto; la inestabilidad de los microsatélites en un solo locus mononucleótido o la ausencia de inestabilidad en cualquiera de los loci analizados se interpreta como microsatélite estable (MSS).

Este ensayo permite realizar pruebas MSI de bajo rendimiento y es ideal para realizar pruebas reflejas o de rescate para obtener o confirmar rápidamente un resultado MSI preciso.

Requisitos del espécimen

Los especímenes aceptables para el ensayo son especímenes de tejido de carcinoma colorrectal fijados en formalina e incluidos en parafina con un tiempo de fijación de 6-48 horas.

Se prefiere un bloque de parafina representativo. Alternativamente, para las muestras de resección se requiere un mínimo de 2 secciones de tejido sin teñir (5 µm de grosor; 50-600mm²).

Instrucciones de almacenamiento y envío

Mantenga y envíe las muestras a temperatura ambiente.

Limitaciones

Es posible que un contenido tumoral insuficiente no permita la detección de inestabilidad MSI: se requiere un 20% de células tumorales. El contenido tumoral se evalúa antes del análisis y se realiza una macrodisección. Los fijadores distintos del formol o un tiempo de fijación prolongado pueden dar lugar a resultados inadecuados.

Requisitos especiales

Ninguno.

Tiempo de entrega

De tres a cinco días laborables para los portaobjetos y los bloques de parafina respectivamente.

1. Umar A, Boland CR, Terdiman JP et al. Revised Bethesda Guidelines for Hereditary Nonpolyposis Colorectal cancer (Lynch Syndrome) and Microsatellite Instability. Journal of the National Cancer Institute 2004;96(4):261-268.
2. De la Chapelle A, Hampel H. Clinical Relevance of Microsatellite Instability in Colorectal Cancer. Journal of Clinical Oncology 2010;28(20):3380-3387.
3. Bacher JW, Flanagan LA, Smalley RL et al. Development of a fluorescent multiplex assay for detection of MSI-High tumors. Disease Markers 2004; 20:237-250.
4. Murphy KM, Zhang S, Geiger T et al. Comparación del sistema de análisis de inestabilidad de microsatélites y el panel Bethesda para la determinación de la inestabilidad de microsatélites en cánceres colorrectales. Journal of Molecular Diagnostics 2006;8(3):305-311.
5. Anderson S, Bloom KJ, Vallera DU et al. Multisite Analytic Performance Studies of a Real-Time Polymerase Chain Reaction Assay for the Detection of BRAF V600E Mutations in Formalin-Fixed Paraffin-Embedded Tissue Specimens of Malignant Melanoma. Arch pathol lab Med 2012;136(11):1385-1391.
6. Buhard O, Suraweera N, Lectard A et al. Quasimonomorphic mononucleotide repeats for high-level microsatellite instability analysis. Disease Markers 2004;20:251-257.
7. Patil DT, Bronner MP, Portier BP et al. A five-marker panel in a multiplex PCR accurately detects microsatellite instability-high colorectal tumors without control DNA. Diagn Mol Pathol 2012 Sep;21(3):127-33.
8. Berg KD, Glaser CL, Thompson RE et al. Detección de la inestabilidad de microsatélites mediante la reacción en cadena de la polimerasa mulitplex de fluorescencia. J Mol Diagn 2000, 2:20-28.
9. De Craene et al. Detección de inestabilidad de microsatélites (MSI) en muestras de cáncer colorrectal con un nuevo conjunto de marcadores altamente sensibles mediante el prototipo de prueba IdyllaTM MSI. Journal of Clinical Oncology 2018; 36:15.

Actualizado el 23 de mayo de 2019