Linda Boettger1,2 e Diane P. Genereux2

1. Stanford University School of Medicine; 2. Broad Institute of MIT e Harvard

Para um cão de raça pura e, ocasionalmente, até mesmo um híbrido de primeira geração, os serviços de interferência de raça muitas vezes apenas confirmam o que o dono do cão já sabe. Às vezes, um pedigree está disponível, rastreando através de várias gerações de ancestrais de raça pura e fornecendo informações essencialmente completas sobre os ancestrais do animal. Em outros casos, a vasta experiência do dono leva à intuição correta de que as orelhas que se descaem junto com o nariz que se afeiçoam devem indicar a ancestralidade do beagle beagle completo ou quase completo. Em contraste, quando aplicada para investigar a ancestralidade de um rafeiro, a inferência baseada em DNA muitas vezes produz conclusões surpreendentes.

A inferência baseada em DNA pode ter grande valor prático. Ela pode ser usada para resolver debates familiares sobre os ancestrais de um amado rafeiro e pode oferecer pelo menos a perspectiva de proteger a saúde de um animal de estimação. Por exemplo, a descoberta de que um mutt tem ascendência de uma raça conhecida por ter um alto risco de câncer poderia recomendar um rastreamento mais frequente de tumores.

Como em qualquer método emergente, no entanto, a inferência da ascendência não é isenta de desafios e incertezas. Aqui, nós fornecemos um histórico potencialmente útil para aqueles que consideram um serviço de ancestralidade ou que lutam para interpretar resultados surpreendentes. Começamos por discutir os processos biológicos que dão origem aos fascinantes e complexos genomas dos rafeiros, depois fornecemos uma visão geral de como as abordagens existentes procuram desembaraçar essa complexidade genómica para fornecer insights sobre a ancestralidade da raça. Concluímos discutindo alguns dos desafios que podem comprometer as inferências dos antepassados, e comentamos que tipo de informação será necessária para resolver esses desafios nos próximos anos.

O que é um cão de raça pura? O que é um cão rafeiro?

Para chegar a uma definição precisa de um cão rafeiro, é útil considerar como os cães surgiram primeiro. Os dados disponíveis sugerem que inicialmente as interações incidentais com humanos poderiam explicar suas origens antigas (Larson e Fuller, 2014). Suponha, por enquanto, que alguns lobos antigos estavam desconfiados dos humanos e que outros estavam comparativamente confortáveis. Sob esta interpretação, a crescente disponibilidade de restos de comida humana à medida que as populações humanas se expandiam poderia ter fornecido uma nova fonte principal de alimento para os lobos mais gregários. Eventualmente, estes animais formaram uma população distinta de animais que preferiam viver nas proximidades dos humanos, e tendiam a acasalar entre si em vez de com seus parentes mais selvagens.

Se, como é exigido em qualquer cenário evolucionário, houvesse uma base genética para o traço que distingue estas duas populações incipientes – aqui, seria um conjunto de mutações que modulam o conforto de um lobo individual em torno de humanos – então é possível que a disponibilidade de alimento perto de populações humanas explique a origem dos cães de seus ancestrais lobos selvagens. É importante notar que, sob este cenário, os cães não foram domesticados pelos humanos per se. Em vez disso, os humanos simplesmente criaram um ambiente que permitiu a auto-domesticação por um subconjunto de lobos que, por acaso, foram geneticamente predispostos a serem pelo menos um pouco tolerantes aos humanos.

Figure 1. As origens das raças modernas. Embora o momento exato permaneça controverso, geralmente pensa-se que os cães surgiram como uma população distinta dos lobos ancestrais na Eurásia entre 10.000 e 40.000 anos atrás (Larson e Fuller, 2014). Sob esse cenário, enquanto a maioria dos lobos continuava desconfiada dos humanos e sujeita à seleção natural na natureza, alguns poucos foram capazes de tolerar a vida perto dos humanos, e talvez tirar proveito do desperdício de comida. Este subconjunto de lobos acabou por dar origem a uma população geneticamente distinta de animais capazes de viver perto de humanos. Raças específicas de cães surgiram muito mais recentemente, com a maioria das raças formadas há menos de 150 anos (Larson et al., 2012). Durante este processo, os cães foram criados em diferentes linhagens por seleção para características específicas como luta, pastoreio, caça, ou apenas por ser um bom companheiro.

Pensa-se geralmente que as raças caninas modernas surgiram há cerca de 150 anos atrás, durante a era vitoriana, após o estabelecimento dos cães dos seus antepassados lobos. Esta inferência vem da observação de que os humanos criam pares de cães acasalados que compartilham características consideradas úteis para tarefas específicas, dando origem a grupos distintos de cães cada vez mais enriquecidos para mutações genéticas que codificam características específicas (Larson et al., 2012). Como em qualquer processo evolutivo, as mutações relevantes surgiram inicialmente de forma aleatória e posteriormente foram favorecidas pela criação seletiva. Vários grupos, incluindo o American Kennel Club e o Kennel Club of India, acabaram por definir raças distintas, dando origem à definição de um cão de raça pura como aquele cuja ascendência inteira é representada por indivíduos listados no livro de criação (“Inherited Defects in Pedigree Dogs”. Parte 2: Distúrbios que não estão relacionados com os padrões da raça,” 2010). No contexto dos processos de criação seletiva que inicialmente estabeleceram, e agora mantêm, raças distintas, um cão rafeiro pode ser definido como um cão cuja ascendência remonta a mais de uma linhagem geneticamente distinta.

O objetivo da inferência de ancestralidade, então, é usar a informação genética de um cão mudo para inferir quais raças de cães estavam presentes entre seus ancestrais, e inferir suas contribuições genéticas relativas.

Coletando DNA de um cão

O primeiro passo na inferência de ancestrais é coletar e extrair DNA para avaliação genética. Felizmente, a saliva é uma grande fonte de DNA – e a maioria dos proprietários acha que é bastante fácil de coletar. Com apenas alguns momentos na boca de um cão, uma das amostras de amostras fornecidas por um serviço comercial de genotipagem normalmente se torna revestida com uma abundância de células. Estas células são na sua maioria de dois tipos: glóbulos brancos, que estão suspensos na saliva e ajudam nas respostas imunológicas, e células epiteliais, que se alinham na boca e são tipicamente substituídas a cada 24 horas. Uma vez coletadas as células, o esfregaço (Fig. 2A) é enviado por correio a uma empresa de referência de ancestrais. Lá, as membranas celulares são quebradas (Fig 2B), liberando o núcleo celular (Fig 2C), que contém o DNA, liberando então o DNA do núcleo (Fig 2D). Proteínas e outras biomoléculas podem então ser lavadas, produzindo uma amostra de DNA de alta qualidade.

Figure 2. Isolamento do DNA para inferência de ancestralidade. Durante alguns momentos na boca de um cão, um esfregaço de saliva (A) capta muitas células epiteliais e imunitárias (B). Em seguida, os núcleos (C) podem ser isolados das células, e então lisados para liberar o DNA (D), que pode então ser limpo e usado para genotipagem ou sequenciamento.

Embora este processo de isolar o DNA dos esfregaços de saliva seja impressionantemente robusto e possa produzir DNA de alta qualidade de cães grandes, cães pequenos, adultos e filhotes de cachorro, ele não está sem seus mistérios. Neste verão, por exemplo, nós e alguns colegas coletamos semanalmente amostras de saliva de seis filhotes de cachorro. Para nossa surpresa, a proporção de sangue branco e células epiteliais por amostra de saliva variou muito entre os indivíduos, e de semana para semana. Ainda mais surpreendente foi o facto de uma cria ter consistentemente mais células por amostra do que as suas irmãs e irmãos. Esperamos eventualmente aprender o que pode explicar esta variação dramática. Por enquanto, no entanto, é reconfortante que mesmo as amostras de menor rendimento normalmente contêm DNA suficiente para a inferência dos ancestrais.

Como fazer um rafeiro: Herança cromossómica e troca

Em humanos e cães, tanto a mãe como o pai fazem contribuições quase iguais para os genomas dos seus descendentes. O genoma do cão é dividido em 38 pares de autossomas (humanos têm 22 conjuntos), e um par de cromossomas sexuais (humanos também têm um par de cromossomas sexuais). Cada um dos 38 pares de autossomas caninos consiste em um cromossoma entregue pelo óvulo da mãe, e um entregue pelo esperma do pai. O genoma da mitocôndria, um pequeno fragmento de DNA que contém muitos genes envolvidos no metabolismo, é sempre contribuído pela mãe.

Para modelar a origem genética de um rafeiro, vamos primeiro considerar o acasalamento de dois cães de raça pura: um Labrador retriever macho e um poodle fêmea. O esperma do macho e o óvulo da fêmea, cada um carregando uma cópia de cada cromossomo, combinam-se para formar uma mistura Labrador-poodle que carrega uma cópia de cada cromossomo contribuído por cada pai.

Figure 3. Um óvulo de um poodle fêmea é fertilizado por um esperma de um Labrador-poodle retriever macho, formando uma mistura Labrador-poodle. Para cada par de cromossomas, a prole tem uma cópia contribuída pela mãe (roxa), e uma cópia contribuída pelo pai (rosa). N.B. Para maior clareza, apenas um dos 39 pares de cromossomos caninos é mostrado nesta e nas figuras seguintes.

Em um acasalamento paralelo, uma mãe beagle fêmea e um pug-mate macho, dando origem a uma mistura pug-beagle macho.

Figure 4. Um óvulo de um beagle fêmea é fertilizado por um esperma de um pug-beagle macho, formando uma mistura de pug-beagle. Para cada par de cromossomos, a prole tem uma cópia contribuída pela mãe (preta), e uma cópia contribuída pelo pai (azul).

Para entender como um vira-lata vem a conter contribuições genéticas de várias raças diferentes, devemos continuar avançando para a próxima geração. Como antes, tanto a mãe – aqui, um labradoodle – quanto o pai – em nenhum lugar, um puggle – contribuem com um dos cromossomos de cada par. No entanto, ao invés de passar os mesmos cromossomas que eles próprios herdaram, os pais contribuem com cromossomas recombinados, que são uma combinação de fragmentos dos seus próprios pais (Figura 5). Neste exemplo, o filhote resultante seria chamado de rafeiro, e tem DNA derivado de ancestrais de quatro raças diferentes.

Figure 5. Um óvulo de um Labrador-poodle fêmea é fertilizado por um esperma de uma mistura macho pug-beagle, formando um mutt. Para cada par de cromossomos, a prole herda uma cópia cromossômica da mãe (roxo e rosa), e uma cópia cromossômica do pai (preto e azul). Neste acasalamento, os dois progenitores são eles próprios de raça mista. Portanto, quando a mistura Labrador-poodle produz ovos e a mistura pug-beagle produz esperma, os cromossomas resultantes contêm DNA de mais de uma raça.

Recombinação envolve um comércio justo de material genético entre os dois cromossomas que compõem cada par. Cada evento de recombinação produz uma nova versão do cromossoma original, para o qual a quantidade total de material genético é a mesma de antes, mas é dividida de forma diferente entre os dois cromossomas. Note que a recombinação é inerente à produção de esperma e ovos – mesmo em um beagle ou poodle de raça pura, os cromossomos dentro de cada par trocam pedaços. As conseqüências são mais aparentes, porém, quando os cromossomos recombinadores têm histórias diferentes.

Inferir a ancestralidade de um rafeiro em comparação com os genomas de referência de cães de raça pura

A inferência da ancestralidade local funciona determinando qual raça provavelmente contribuiu com cada pedaço do genoma de um rafeiro. Uma vez feita uma inferência para cada pedaço de cromossomo, essas inferências podem ser somadas para estimar a fração total do genoma de um mutt contribuído por cada raça inferida.

Para inferir o contribuinte mais provável de um determinado pedaço de cromossomo, é claro, precisamos de alguma forma de distinguir entre as contribuições genéticas de várias raças. Felizmente, enquanto a maioria do genoma é muito semelhante em todos os cães, cada raça contém alterações genéticas específicas – chamadas mutações – que são ou únicas, ou pelo menos muito mais comuns nela do que em qualquer outra raça. Algumas destas mutações são directamente relevantes para as características de uma raça em particular. Outras simplesmente são únicas ou mais comuns numa raça do que noutras, mas não têm qualquer relevância conhecida para as características físicas específicas da raça. As mutações de ambos os tipos são úteis para a inferência dos ancestrais. Nas Figuras 3-6, mutações específicas de raças individuais, úteis para inferir a ancestralidade da raça, são representadas pela cor cromossômica.

Figure 6. Inferring breed ancestry comparando um genoma mutt a um conjunto de genomas de referência. Para inferir a ancestralidade da raça para um mutt, um conjunto de genomas de referência da raça (A) é coletado, e então comparado com o genoma mutt de interesse (B) para permitir a inferência da ancestralidade para cada cromossomo, e estimar as contribuições globais da ancestralidade. O mudo acima é inferido como tendo contribuições aproximadamente iguais de pug, Labrador retriever, poodle, e ancestrais beagle, como esperado dado que ele teve um avô de cada uma dessas quatro diferentes raças.

Os passos para inferir a ancestralidade de um rafeiro são então para:

1. Colher um conjunto de dados genéticos de cães de raça pura (Figura 6A)
2. Colher dados genéticos do mutt de interesse (Figura 6B)
3. Comparar o genoma mutt com um genoma de referência, fazer os melhores palpites sobre a origem da raça para cada pedaço de cromossomo, e soma entre esses pedaços cromossômicos para estimar a ancestralidade geral da raça (Figura 6C)

Dados de até mesmo uma pequena fração do genoma de um cão rafeiro podem ser úteis para a inferência da ancestralidade

O genoma de um cão contém cerca de 2.5 bilhões de nucleotídeos – As,Ts, Cs, e Gs que compõem o DNA. Isto não é drasticamente diferente dos cerca de 3 bilhões de nucleotídeos que compõem o genoma humano. Em um mundo ideal, é claro, seria financeiramente viável coletar dados de seqüências de todo o genoma de cada cão. Ao longo das últimas duas décadas, nós nos aproximamos desse objetivo. Em 2001, quando a primeira sequência completa do genoma humano foi publicada, a sequência de cada um dos nossos cerca de 3 bilhões de nucleotídeos custou 2,7 bilhões de dólares. Um declínio maciço nos custos de seqüenciamento possibilitou empreendimentos de larga escala como o Projeto 1.000 Genomas, que catalogou seqüências de genomas inteiros de humanos em todo o mundo.

Embora estes preços diminuam, ainda custa cerca de $1.400 para sequenciar todo o genoma de um cão aqui na Broad Institute’s Genomics Platform. Este preço é certamente uma grande melhoria em relação aos preços anteriores, mas continua a ser substancial. Felizmente, a genotipagem proporciona uma alternativa mais barata – e ainda muito informativa – alternativa. Em contraste com a sequenciação do genoma inteiro, a genotipagem avalia um subconjunto de nucleotídeos dentro do genoma. No caso do genoma canino, por exemplo, os testes de chip mais populares dizem cerca de 170.000 mutações.

É, a princípio, difícil imaginar como dados de apenas cerca de 0,000068% do genoma de um mutt (170.000 de 2,5 bilhões) poderiam fornecer um proxy adequado para o genoma em geral. Parte da resposta está nos detalhes do processo de recombinação mencionado acima. A cada geração, os pedaços cromossômicos derivados de um determinado antepassado tornam-se cada vez menores. Apesar destas descidas de comprimento, os pedaços cromossómicos permanecem, durante muitas gerações, grandes em relação a todo o genoma. Portanto, com algumas advertências importantes – e um reconhecimento de que alguns erros inevitavelmente ocorrerão – é tipicamente razoável usar a identidade de um nucleotídeo no genoma de um mutt para fazer um palpite sobre a identidade de um nucleotídeo vizinho (Figura 7). Esta abordagem, chamada de imputação, melhorou enormemente as oportunidades de inferência comparativamente de baixo custo de componentes ancestrais em cães de raça mista.

Figure 7. A imputação utiliza informações genotípicas de alguns nucleotídeos para fazer suposições informadas sobre outros. Para um cromossomo formado por recombinação de DNA do poodle (roxo) e Labrador retriever (rosa) DNA, identificando ancestralidade da raça das posições 1 e 2, que foram contribuídas por Labrador retriever, permite um palpite correto sobre a origem da raça da região ao redor. Em contraste, a posição 3 está próxima de um ponto de quebra entre os pedaços cromossômicos; dados desse local levam a um palpite correto sobre a origem das posições à esquerda mas não à direita da posição amostrada.

Como funciona um chip de genotipagem?

Chips de genotipagem canina projetados por empresas como Affymetrix e Illumina são otimizados para identificar mutações relevantes à doença. O resultado é que apenas o subconjunto de mutações com maior probabilidade de serem clinicamente informativas são interrogados para cada cão, mantendo os custos baixos.

DNA é uma molécula muito pegajosa de dupla cadeia na qual cada cadeia quer se ligar à outra, sequência complementar. No DNA de toda a vida na terra, A (adenina) se emparelha com T (timina), e C (citosina) se emparelha com G (guanina). Portanto, a sequência de ADN “ATCG” se colaria à sequência complementar “TAGC”. Contudo, mesmo uma diferença de uma letra (isto é, “TGGC”) pode impedir que os dois pedaços de ADN se liguem um ao outro. Os chips de genotipagem aproveitam este princípio de ligação seletiva para determinar quais mutações estão presentes em um determinado cão. As sondas de DNA são projetadas para ligar seções do DNA de um cão contendo a mutação, e alternativamente a forma não mutante do DNA. Estas sequências curtas são ligadas ao topo de uma pequena lâmina de vidro comumente chamada de “chip” ou “array” (Figura 8).

Figure 8. Genotipagem para determinar quais as mutações que cada cão tem. As sondas de DNA (sequências curtas complementares às mutações de interesse) estão presentes em diferentes locais na matriz de genotipagem. Aqui ilustramos a detecção de uma das milhares de mutações ensaiadas pelo chip. Depois que o DNA do cão é adicionado e permitido se ligar ao DNA do chip, o DNA que não foi ligado é lavado. A seguir, são adicionadas moléculas fluorescentes que se ligam ao ADN de cão restante. Desta forma, as mutações presentes em um cão podem ser identificadas visualizando quais regiões da matriz de genotipagem estão brilhando.

Para garantir a ligação a estas sondas de genotipagem curtas, o DNA isolado da saliva de um mutt é primeiro quebrado em pequenos pedaços. Em seguida, um químico é ligado ao DNA do cão que é ótimo em aderir a moléculas fluorescentes que serão críticas para a interpretação dos resultados. O ADN do rafeiro é lavado sobre o chip e cada fio liga a sua sequência de sondas complementares. Assim, pedaços do DNA do rafeiro encontram a sonda correspondente no chip de genotipagem. Duas características garantem uma ligação específica e, portanto, dados confiáveis. Primeiro, uma sonda de genotipagem não pode ligar o DNA do rafeiro derivado de uma parte diferente do genoma. Segundo, ela não pode ligar a forma mutante da sequência, a menos que o cão tenha essa mutação específica (ou seja, a sequência “A” ilustrada acima). O DNA não ligado é lavado da lâmina, e por último, moléculas fluorescentes são ligadas ao DNA restante que ligou com sucesso as sondas. Como cada sonda foi criada em um local específico no array, podemos interpretar quais mutações um cão tem observando quais pequenos pontos no array estão brilhando.

Fatores que podem minar a inferência de ancestralidade

Embora os avanços recentes, vários desafios persistentes podem minar os esforços para inferência precisa da ancestralidade da raça em cães de raça mista.

Figure 9. Um ancestral só pode ser inferido se o genoma relevante estiver presente no conjunto de referência. Para raças que são bem representadas entre genomas de referência, e bem amostradas por uma matriz de genotipagem (por exemplo, poodle, pug, e Labrador retriever no cenário acima) os esforços de referência de ancestrais serão tipicamente bem sucedidos em identificar tanto a presença quanto a porcentagem aproximada de DNA contribuído por ancestrais recentes daquela raça. Entretanto, para raças não bem representadas entre os genomas de referência (por exemplo, beagle no cenário acima), os pedaços de cromossomas são frequentemente mal atribuídos a uma raça melhor representada (por exemplo, basset hound no cenário acima), levando a uma avaliação incorreta da ancestralidade de um mutt.

Embora alguns problemas possam resultar em apenas subestimar a porcentagem de ancestralidade de um mutt que deriva de uma raça específica, outros problemas podem impedir que a raça correta seja identificada. O mais substancial destes problemas é a ausência da verdadeira raça ancestral do conjunto de dados de referência (Figura 9). Como a ancestralidade da raça é inferida pela comparação de pedaços de DNA mutt com cães puros de raças conhecidas, se uma raça está ausente do conjunto de dados de referência, essa raça simplesmente não pode ser detectada, mesmo que tenha contribuído com uma fração muito grande do DNA de um mutt. Este problema só será resolvido através da inclusão de genomas de referência de raças reconhecidas; entretanto, se estiver interessado em saber se o seu cão tem ascendência de uma raça rara específica, é importante certificar-se de que a sua companhia de ascendência de raça de escolha é capaz de verificar essa raça. Para aqueles que decidem proceder com a inferência de ancestralidade mesmo sabendo que a raça de interesse está ausente do conjunto de referência, é importante ter em mente que a ausência dessa raça da lista de ancestrais inferidos não fornece nenhuma informação sobre se o cão rafeiro realmente não tem essa ancestralidade específica.

As mutações selecionadas para genotipagem também determinam quais ancestrais de raça podem ser identificados com precisão em um cão de raça mista. As matrizes de genotipagem tendem a incluir mais mutações presentes em raças comuns. Isso significa que pedaços de cromossomos de poodles e pastores alemães podem ser especialmente fáceis de identificar porque muitas das mutações comuns nessas raças são testadas em matrizes de genotipagem. Embora muitas mutações possam ajudar a identificar pedaços de DNA de raças raras como cães cantores da Nova Guiné ou Skye terriers, algumas destas mutações podem não estar representadas em matrizes de genotipagem amplamente utilizadas, o que pode tornar estas raças mais difíceis de identificar. Este problema será eventualmente resolvido através da criação de conjuntos de dados de referência de raça com dados de sequência, o que permitiria a interpretação de muitas mais mutações e não seria tendencioso para a detecção de ancestrais de raças específicas.

A relação do mutt com os seus antepassados de raça pura também afecta a fiabilidade da determinação da raça. Em particular, é mais fácil identificar a ancestralidade racial do DNA de um ancestral de raça pura que é um parente próximo (como um pai), porque as mutações de ancestrais recentes residirão em pedaços mais longos de DNA com mutações mais informativas. Por exemplo, enquanto a primeira mutação observada no cromossoma de um carneiro pode ser comum em ambos Labradores e Golden Retrievers, talvez a primeira, segunda, e terceira mutações observadas só são vistas juntas em Golden Retrievers. O DNA contribuído por ancestrais de muitas gerações atrás existirá como apenas pequenos pedaços de cromossomos, com menos mutações para ajudar a identificar sua contribuição para a ancestralidade do rafeiro, tornando a inferência mais difícil. Esta questão pode ser mitigada usando dados de seqüenciamento ao invés de genotipagem, permitindo que todas as mutações sejam analisadas. Entretanto, o DNA herdado de muitas gerações atrás pode estar em pedaços cromossômicos tão curtos que não conterá pedaços cromossômicos característicos de uma raça específica, de tal forma que as contribuições da raça para os ancestrais de um mutt não podem ser detectadas mesmo com dados do genoma inteiro (Li et al., 2014).

O que vem a seguir? Devo genotipar o meu cão?

Como com qualquer nova tecnologia, a inferência da raça é uma oportunidade excitante que introduz alguns desafios não resolvidos. Muitos donos de cães intrigados em aprender mais sobre as origens do seu animal de estimação certamente apreciarão ter uma janela na qual as raças contribuíram para a genética única do seu cão rafeiro. Pode até ganhar o direito de especular que a excelente resistência do seu cão a grande altitude vem do seu avô Lhasa Apso (Li et al., 2014)! Mesmo assim, pedimos aos donos que sejam cautelosos e lembrem-se que uma variedade de problemas pode comprometer a confiabilidade das inferências, permanecendo otimistas de que as inferências irão melhorar à medida que os dados de referência acumulam.

“Defeitos Hereditários em Cães de Pedigree”. Parte 2: Distúrbios que não estão relacionados com os padrões da raça”. 2010. The Veterinary Journal 183 (1). W.B. Saunders:39-45.

Larson, Greger, e Dorian Q. Fuller. 2014. “The Evolution of Animal Domestication.” Annual Review of Ecology, Evolution, and Systematics 45 (1):115-36.

Larson, Greger, Elinor K. Karlsson, Angela Perri, Matthew T. Webster, Simon Y. W. Ho, Joris Peters, Peter W. Stahl, et al. 2012. “Repensando a domesticação de cães através da integração da genética, arqueologia e biogeografia”. Anais da Academia Nacional de Ciências dos Estados Unidos da América 109 (23):8878-83.

Li, Yan, Dong-Dong Wu, Adam R. Boyko, Guo-Dong Wang, Shi-Fang Wu, David M. Irwin, e Ya-Ping Zhang. 2014. “Variação da População Revelou Adaptação a Alta Altitude dos Mastins Tibetanos.” Biologia Molecular e Evolução 31 (5):1200-1205.