Christian Bohr și conceptul de legare cooperantăEdit

În 1904, Christian Bohr a studiat legarea hemoglobinei de oxigen în diferite condiții. La reprezentarea grafică a saturației hemoglobinei cu oxigen în funcție de presiunea parțială a oxigenului, el a obținut o curbă sigmoidală (sau “în formă de S”). Acest lucru indică faptul că, cu cât mai mult oxigen este legat de hemoglobină, cu atât este mai ușor pentru mai mult oxigen să se lege – până când toate situsurile de legare sunt saturate. În plus, Bohr a observat că o creștere a presiunii CO2 a deplasat această curbă spre dreapta – adică concentrațiile mai mari de CO2 fac mai dificilă pentru hemoglobină legarea oxigenului. Acest din urmă fenomen, împreună cu observația că afinitatea hemoglobinei pentru oxigen crește odată cu creșterea pH-ului, este cunoscut sub numele de efectul Bohr.

Figura originală de la Christian Bohr, care arată creșterea sigmoidală a oxihemoglobinei în funcție de presiunea parțială a oxigenului.

Se spune că o moleculă receptoare prezintă o legare cooperantă dacă legarea sa la ligand scalează neliniar cu concentrația ligandului. Cooperativitatea poate fi pozitivă (dacă legarea unei molecule de ligand crește afinitatea aparentă a receptorului și, prin urmare, crește șansele ca o altă moleculă de ligand să se lege) sau negativă (dacă legarea unei molecule de ligand scade afinitatea și, prin urmare, face ca legarea altor molecule de ligand să fie mai puțin probabilă). “Ocuparea fracționară” Y ¯ {\displaystyle {\bar {Y}}}}

a unui receptor cu un anumit ligand este definită ca fiind cantitatea de situsuri de legare legate de ligand împărțită la cantitatea totală de situsuri de legare a ligandului: Y ¯ = + = {\displaystyle {\bar {Y}}={\frac {}{+}}={\frac {}{}{}}}}

Dacă Y ¯ = 0 {\displaystyle {\bar {Y}}=0}

, atunci proteina este complet nelegată, iar dacă Y ¯ = 1 {\displaystyle {\bar {Y}}=1}

, aceasta este complet saturată. În cazul în care graficul lui Y ¯ {\displaystyle {\bar {Y}} {\displaystyle {\bar {Y}}.

la echilibru în funcție de concentrația ligandului are o formă sigmoidală, așa cum a observat Bohr pentru hemoglobină, acest lucru indică o cooperativitate pozitivă. Dacă nu este așa, nu se poate face nici o afirmație despre cooperativitate doar din analiza acestui grafic.

Conceptul de legare cooperativă se aplică numai moleculelor sau complexelor cu mai multe situsuri de legare a ligandului. Dacă există mai multe situsuri de legare a ligandului, dar legarea ligandului la oricare dintre ele nu le afectează pe celelalte, se spune că receptorul este necooperant. Cooperativitatea poate fi homotropică, dacă un ligand influențează legarea liganzilor de același tip, sau heterotropică, dacă influențează legarea altor tipuri de liganzi. În cazul hemoglobinei, Bohr a observat o cooperativitate pozitivă homotropă (legarea oxigenului facilitează legarea unui număr mai mare de oxigen) și o cooperativitate negativă heterotropă (legarea CO2 reduce capacitatea hemoglobinei de a lega oxigenul.)

De-a lungul secolului al XX-lea, au fost dezvoltate diverse cadre pentru a descrie legarea unui ligand la o proteină cu mai mult de un situs de legare și efectele cooperative observate în acest context.

Ecuația HillEdit

Prima descriere a legării cooperative la o proteină cu mai multe situsuri a fost dezvoltată de A.V. Hill. Bazându-se pe observațiile legate de legarea oxigenului la hemoglobină și pe ideea că cooperativitatea provine din agregarea moleculelor de hemoglobină, fiecare dintre ele legând câte o moleculă de oxigen, Hill a sugerat o ecuație fenomenologică care de atunci a fost numită după el:

Reprezentarea grafică a ecuației Hill în roșu, arătând că panta curbei este coeficientul Hill, iar intercepția cu axa x furnizează constanta de disociere aparentă. Linia verde arată curba necooperantă.

Y ¯ = K ⋅ n 1 + K ⋅ n = n K ∗ + n = n K d n + n {\displaystyle {\bar {Y}}={\frac {K\cdot {}^{n}}}{1+K\cdot {}^{n}}}={\frac {^{n}}}{K^{*}+^{n}}}={\frac {^{n}}}{K_{d}^{n}+^{n}}{\frac {^{n}}{K_{d}^{n}+^{n}}}}

unde n {\displaystyle n}

este “coeficientul Hill”, {\displaystyle }

reprezintă concentrația ligandului, K {\displaystyle K}

reprezintă o constantă de asociere aparentă (utilizată în forma originală a ecuației), K ∗ {\displaystyle K^{*}}}

reprezintă o constantă de disociere empirică, iar K d {\displaystyle K_{d}}

o constantă de disociere microscopică (utilizată în formele moderne ale ecuației și echivalentă cu un E C 50 {\displaystyle \mathrm {EC} _{50}}

). Dacă n < 1 {\displaystyle n<1}

, sistemul prezintă o cooperativitate negativă, în timp ce cooperativitatea este pozitivă dacă n > 1 {\displaystyle n>1}

. Numărul total de situsuri de legare a ligandului este o limită superioară pentru n {\displaystyle n}

. Ecuația Hill poate fi liniarizată sub forma: log Y ¯ 1 – Y ¯ = n ⋅ log – n ⋅ log K d {\displaystyle \log {\frac {\bar {Y}}{1-{\bar {Y}}}}=n\cdot {}\log-n\cdot {}\log K_{d}}}

“Hill plot” se obține prin reprezentarea grafică a log Y ¯ 1 – Y ¯ {\displaystyle \log {\frac {\bar {Y}}{1-{\bar {Y}}}}}

față de log {\displaystyle \log}

. În cazul ecuației Hill, aceasta este o dreaptă cu panta n H {\displaystyle n_{H}}.

și intercept log ( K d ) {\displaystyle \log(K_{d})}

. Aceasta înseamnă că se presupune că cooperativitatea este fixă, adică nu se modifică odată cu saturația. Aceasta înseamnă, de asemenea, că situsurile de legare prezintă întotdeauna aceeași afinitate, iar cooperativitatea nu rezultă dintr-o afinitate care crește odată cu concentrația ligandului.

Ecuația AdairEdit

G.S. Adair a constatat că graficul Hill pentru hemoglobină nu era o linie dreaptă și a emis ipoteza că afinitatea de legare nu era un termen fix, ci depindea de saturația ligandului. După ce a demonstrat că hemoglobina conținea patru heme (și, prin urmare, situsuri de legare pentru oxigen), el a lucrat pornind de la ipoteza că hemoglobina complet saturată se formează în etape, cu forme intermediare cu una, două sau trei molecule de oxigen legate. Formarea fiecărui stadiu intermediar din hemoglobina nelegată poate fi descrisă cu ajutorul unei constante de asociere macroscopice aparente K i {\displaystyle K_{i}}.

. Ocuparea fracționată rezultată poate fi exprimată ca: Y ¯ = 1 4 ⋅ K I + 2 K I I 2 + 3 K I I I I 3 + 4 K I V 4 1 + K I + K I I 2 + K I I I I 3 + K I V 4 {\displaystyle {\bar {Y}}={\frac {1}{4}}\cdot {}{\frac {K_{I}+2K_{II}^{2}+3K_{III}^{3}+4K_{IV}^{4}}{1+K_{I}+K_{II}^{2}+K_{III}^{3}+K_{IV}^{4}}}}

Or, pentru orice proteină cu n situsuri de legare a ligandului:

Y ¯ = 1 n K I + 2 K I I I 2 + … + n K n n n 1 + K I + K I + K I I 2 + … + K n n n {\displaystyle {\bar {Y}}={\frac {1}{n}}}{\frac {K_{I}+2K_{II}^{2}+\ldots +nK_{n}^{n}}}{1+K_{I}+K_{II}^{2}+\ldots +K_{n}^{n}}}}

unde n reprezintă numărul de situsuri de legare și fiecare K i {\displaystyle K_{i}}

este o constantă de asociere combinată, care descrie legarea a i molecule de ligand. prin combinarea tratamentului Adair cu diagrama Hill, se ajunge la definiția experimentală modernă a cooperativității (Hill, 1985, Abeliovich, 2005). Se poate demonstra că coeficientul Hill rezultat sau, mai corect, panta graficului Hill calculată din ecuația Adair, reprezintă raportul dintre varianța numărului de legare și varianța numărului de legare într-un sistem echivalent de situsuri de legare care nu interacționează între ele. Astfel, coeficientul Hill definește cooperativitatea ca o dependență statistică a unui situs de legare de starea altui situs (altor situsuri).

Ecuația lui KlotzEdit

Lucrând asupra proteinelor de legare a calciului, Irving Klotz a deconvoluit constantele de asociere ale lui Adair luând în considerare formarea în trepte a etapelor intermediare și a încercat să exprime legarea cooperativă în termeni de procese elementare guvernate de legea acțiunii de masă. În cadrul său, K 1 {\displaystyle K_{1}}

este constanta de asociere care guvernează legarea primei molecule de ligand, K 2 {\displaystyle K_{2}}

este constanta de asociere care guvernează legarea celei de-a doua molecule de ligand (odată ce prima este deja legată) etc. Pentru Y ¯ {\displaystyle {\bar{Y}}}

, rezultă: Y ¯ = 1 n K 1 + 2 K 1 K 2 2 2 + … + n ( K 1 K 2 … K n ) n 1 + K 1 + K 1 K 2 2 2 + … + ( K 1 K 2 … K n ) n {\displaystyle {\bar {Y}}={\frac {1}{n}}}{\frac {K_{1}+2K_{1}K_{2}^{2}+\ldots +n\left(K_{1}K_{2}\ldots K_{n}\right)^{n}}{1+K_{1}+K_{1}K_{2}^{2}+\ldots +\left(K_{1}K_{2}\ldots K_{n}\right)^{n}}}}

Este demn de remarcat faptul că constantele K 1 {\displaystyle K_{1}}

, K 2 {\displaystyle K_{2}}

și așa mai departe nu se referă la situsuri de legare individuale. Ele descriu câte situsuri de legare sunt ocupate, mai degrabă decât care dintre ele. Această formă are avantajul de a recunoaște cu ușurință cooperativitatea atunci când se iau în considerare constantele de asociere. Dacă toate situsurile de legare a ligandului sunt identice, cu o constantă de asociere microscopică K {\displaystyle K}

, ar trebui să ne așteptăm ca K 1 = n K , K 2 = n – 1 2 K , … K n = 1 n n K {\displaystyle K_{1}=nK,K_{2}={\frac {n-1}{2}}K,\ldots K_{n}={\frac {1}{n}}K}

(adică K i = n – i + 1 i K {\displaystyle K_{i}={\frac {n-i+1}{i}}K}

) în absența cooperativității. Avem o cooperativitate pozitivă dacă K i {\displaystyle K_{i}}}.

se situează peste aceste valori așteptate pentru i > 1 {\displaystyle i>1}

.

Ecuația Klotz (care se mai numește uneori și ecuația Adair-Klotz) este încă adesea folosită în literatura experimentală pentru a descrie măsurătorile de legare a ligandului în termeni de constante de legare aparentă secvențială.

Ecuația PaulingEdit

Până la mijlocul secolului XX, a existat un interes crescut pentru modele care nu numai că ar descrie fenomenologic curbele de legare, dar ar oferi și un mecanism biochimic subiacent. Linus Pauling a reinterpretat ecuația furnizată de Adair, presupunând că constantele sale erau combinația dintre constanta de legare pentru ligand ( K {\displaystyle K}

în ecuația de mai jos) și energia provenită din interacțiunea dintre subunitățile proteinei cooperative ( α {\displaystyle \alpha }

de mai jos). Pauling a derivat de fapt mai multe ecuații, în funcție de gradul de interacțiune dintre subunități. Pe baza unor ipoteze greșite cu privire la localizarea hemelor, el a optat pentru cea greșită pentru a descrie legarea oxigenului de către hemoglobină, presupunând că subunitățile erau dispuse într-un pătrat. Ecuația de mai jos oferă ecuația pentru o structură tetraedrică, care ar fi mai exactă în cazul hemoglobinei: Y ¯ = K + 3 α K 2 2 2 + 3 α 3 K 3 3 3 + α 6 K 4 4 1 + 4 K + 6 α K 2 2 + 4 α 3 K 3 3 3 + α 6 K 4 4 4 {\displaystyle {\bar {Y}}={\frac {K+3\alpha {}K^{{2}^{2}^{2}+3\alpha {}^{3}K^{3}^{3}^{3}+\alpha {}^{6}K^{4}^{4}}}{1+4K+6\alpha {}K^{2}^{2}^{2}+4\alpha {}^{3}K^{3}^{3}^{3}+\alpha {}^{6}K^{4}^{4}^{4}}}}

Modelul KNFEdit

Bazat pe rezultatele care arată că structura proteinelor cooperative se modifică la legarea de ligandul lor, Daniel Koshland și colegii săi au rafinat explicația biochimică a mecanismului descris de Pauling. Modelul Koshland-Némethy-Filmer (KNF) presupune că fiecare subunitate poate exista într-una dintre cele două conformații: activă sau inactivă. Legarea ligandului la o subunitate ar induce o schimbare conformațională imediată a acelei subunități de la conformația inactivă la cea activă, un mecanism descris drept “potrivire indusă”. Cooperativitatea, conform modelului KNF, ar rezulta din interacțiunile dintre subunități, a căror forță variază în funcție de conformațiile relative ale subunităților implicate. Pentru o structură tetraedrică (au luat în considerare și structuri liniare și pătrate), au propus următoarea formulă:

Y ¯ = K A B 3 ( K X K t ) + 3 K A B 4 K B B ( K X K t ) 2 + 3 K A B 3 K B B B 3 ( K X K t ) 3 + K B B 6 ( K X K t ) 4 1 + 4 K A B 3 ( K X K t ) + 6 K A B 4 K B B ( K X K t ) 2 + 4 K A B 3 K B B B 3 ( K X K t ) 3 + K B B 6 ( K X K t ) 4 {\displaystyle {\bar {Y}}={\frac {K_{AB}^{3}(K_{X}K_{t})+3K_{AB}^{4}K_{BB}(K_{X}K_{t})^{2}+3K_{AB}^{3}K_{BB}^{3}(K_{X}K_{t})^{3}+K_{BB}^{6}(K_{X}K_{t})^{4}}{1+4K_{AB}^{3}(K_{X}K_{t})+6K_{AB}^{4}K_{BB}(K_{X}K_{t})^{2}+4K_{AB}^{3}K_{BB}^{3}(K_{X}K_{t})^{3}+K_{BB}^{6}(K_{X}K_{t})^{4}}}}

Unde K X {\displaystyle K_{X}}

este constanta de asociere pentru X, K t {\displaystyle K_{t}}

este raportul dintre stările B și A în absența ligandului (“tranziție”), K A B {\displaystyle K_{AB}}

și K B B {\displaystyle K_{BB}}

sunt stabilitățile relative ale perechilor de subunități vecine în raport cu o pereche în care ambele subunități se află în starea A (Rețineți că lucrarea KNF prezintă de fapt N s {\displaystyle N_{s}}

, numărul de situsuri ocupate, care este aici de 4 ori Y ¯ {\displaystyle {\bar {Y}}}.

).

Modelul MWCEdit

Schema de reacție a modelului Monod-Wyman-Changeux a unei proteine alcătuită din doi protomeri. Protomerul poate exista sub două stări, fiecare cu o afinitate diferită pentru ligand. L este raportul dintre stări în absența ligandului, c este raportul dintre afinități.

Diagrama energetică a unui model Monod-Wyman-Changeux al unei proteine alcătuite din doi protomeri. Afinitatea mai mare a ligandului pentru starea R înseamnă că aceasta din urmă este stabilizată preferențial prin legare.

Modelul Monod-Wyman-Changeux (MWC) pentru tranzițiile alosterice concertate a făcut un pas mai departe prin explorarea cooperativității pe baza termodinamicii și a conformațiilor tridimensionale. Acesta a fost inițial formulat pentru proteine oligomerice cu subunități identice, dispuse simetric, fiecare dintre ele având un situs de legare a ligandului. În conformitate cu acest cadru, două (sau mai multe) stări conformaționale interconvertibile ale unei proteine alosterice coexistă într-un echilibru termic. Aceste stări – adesea denumite tensionată (T) și relaxată (R) – diferă în ceea ce privește afinitatea pentru molecula de ligand. Raportul dintre cele două stări este reglat de legarea moleculelor de ligand care stabilizează starea cu afinitate mai mare. Este important faptul că toate subunitățile unei molecule își schimbă stările în același timp, un fenomen cunoscut sub numele de “tranziție concertată”.

Constanta de izomerizare alosterică L descrie echilibrul dintre cele două stări atunci când nu este legată nicio moleculă de ligand: L = {\displaystyle L={\frac {\left}{\left}}}}.

. Dacă L este foarte mare, cea mai mare parte a proteinei există în starea T în absența ligandului. Dacă L este mic (aproape de unu), starea R este aproape la fel de populată ca și starea T. Raportul dintre constantele de disociere pentru ligandul din stările T și R este descris de constanta c: c = K d R K d T {\displaystyle c={\frac {K_{d}^{R}}{K_{d}^{T}}}}

. Dacă c = 1 {\displaystyle c=1}

, ambele stări R și T au aceeași afinitate pentru ligand și ligandul nu afectează izomerizarea. Valoarea lui c indică, de asemenea, cât de mult se modifică echilibrul între stările T și R la legarea ligandului: cu cât c este mai mic, cu atât mai mult echilibrul se deplasează spre starea R după o legare. Cu α = K d R {\displaystyle \alpha ={\frac {}{K_{d}^{R}}}}

, ocuparea fracționată este descrisă astfel: Y ¯ = α ( 1 + α ) n – 1 + L c α ( 1 + c α ) n – 1 ( 1 + α ) n + L ( 1 + c α ) n {\displaystyle {\bar {Y}}={\frac {\alpha (1+\alpha )^{n-1}+Lc\alpha (1+c\alpha )^{n-1}}}{(1+\alpha )^{n}+L(1+c\alpha )^{n}}}}

Pratgraficul Hill sigmoid al proteinelor alosterice poate fi apoi analizat ca o tranziție progresivă de la starea T (afinitate mică) la starea R (afinitate mare) pe măsură ce crește saturația. Panta graficului Hill depinde, de asemenea, de saturație, cu o valoare maximă la punctul de inflexiune. Interceptele dintre cele două asimptote și axa y permit să se determine afinitățile celor două stări pentru ligand.

Graficul Hill al funcției de legare a MWC în roșu, al stării pure T și R în verde. Pe măsură ce conformația se deplasează de la T la R, la fel se întâmplă și cu funcția de legare. Interceptele cu axa x furnizează constanta de disociere aparentă, precum și constantele de disociere microscopice ale stărilor R și T.

În proteine, schimbarea conformațională este adesea asociată cu activitatea, sau cu activitatea față de ținte specifice. O astfel de activitate este adesea ceea ce este relevant din punct de vedere fiziologic sau ceea ce este măsurat experimental. Gradul de modificare conformațională este descris de funcția de stare R ¯ {\displaystyle {\bar {R}}}.

, care denotă fracțiunea de proteină prezentă în R {\displaystyle R}

state. După cum ilustrează diagrama energetică, R ¯ {\displaystyle {\bar {R}}}

crește pe măsură ce se leagă mai multe molecule de ligand. Expresia pentru R ¯ {\displaystyle {\bar {R}}}}.

este: R ¯ = ( 1 + α ) n ( 1 + α ) n + L ( 1 + c α ) n {\displaystyle {\bar {R}}={\frac {(1+\alpha )^{n}}{(1+\alpha )^{n}+L(1+c\alpha )^{n}}}}

Un aspect crucial al modelului MWC este faptul că curbele pentru Y ¯ {\displaystyle {\bar {Y}}}

și R ¯ {\displaystyle {\bar {R}}}

nu coincid, adică saturația fracțională nu este un indicator direct al stării conformaționale (și, prin urmare, al activității). Mai mult, amplitudinile cooperativității de legare și cooperativității de activare pot fi foarte diferite: un caz extrem este oferit de motorul flagelului bacterian cu un coeficient Hill de 1,7 pentru legare și de 10,3 pentru activare. Supraliniaritatea răspunsului se numește uneori ultrasensibilitate.

Dacă o proteină alosterică se leagă de o țintă care are, de asemenea, o afinitate mai mare pentru starea R, atunci legarea țintei stabilizează și mai mult starea R, crescând astfel afinitatea ligandului. Dacă, pe de altă parte, o țintă se leagă preferențial de starea T, atunci legarea țintei va avea un efect negativ asupra afinității ligandului. Astfel de ținte se numesc modulatori alosterici.

De la începuturile sale, cadrul MWC a fost extins și generalizat. Au fost propuse variații, de exemplu, pentru a răspunde proteinelor cu mai mult de două stări, proteinelor care se leagă la mai multe tipuri de liganzi sau la mai multe tipuri de modulatori alosterici și proteinelor cu subunități sau situsuri de legare a liganzilor neidentice.