Mathis comenzó a actuar profesionalmente a los 16 años. Su primer trabajo fue un anuncio de “Always Slender Pads – Just For Teens”. Coprotagonizó las series de televisión Aaron’s Way y Knightwatch de 1988 a 1989. Su primer papel protagonista en un largometraje fue el de Nora en Pump Up the Volume (1990), junto a Christian Slater, con quien salió brevemente en ese momento. Mathis se tiñó su pelo rubio natural de negro para el papel, en un esfuerzo por cambiar su imagen de dulce e inocente a fuerte.
Mathis apareció en las películas para televisión Extreme Close-up, 83 Hours ’til Dawn y To My Daughter en 1990. Mathis y Slater tuvieron papeles de voz en la película de animación FernGully: The Last Rainforest (1992). Luego apareció en la comedia This Is My Life (1992), escrita y dirigida por Nora Ephron, interpretando a una adolescente insegura. Mathis apareció en la obra Fortinbras en Nueva York en octubre de 1992. Super Mario Bros. (1993), en la que interpretó a la princesa Daisy del popular videojuego de Nintendo, fue una bomba de taquilla, pero ganó seguidores de culto desde su estreno.
Mathis conoció al actor River Phoenix en el plató de La cosa llamada amor (1993) y ambos iniciaron una relación. Ella estaba con Phoenix el 31 de octubre de 1993, la noche en que él murió en el hospital Cedars-Sinai por una sobredosis de drogas tras desplomarse a la salida del Viper Room de West Hollywood. Hizo la película Jack y Sarah (1995), que se rodó en Londres, para salir del país tras su muerte debido a la excesiva cobertura de la prensa.
Mathis apareció en la adaptación cinematográfica de 1994 de Mujercitas, y en Cómo hacer una colcha americana (1995), ambas protagonizadas por Winona Ryder. Después apareció en El presidente americano (1995), interpretando a la asistente del presidente de los Estados Unidos. Mathis volvió a actuar con Christian Slater, junto a John Travolta, en Broken Arrow (1996), de John Woo. Se tomó algo más de un año de descanso tras la muerte de su madre en 1996 a causa de un cáncer de mama.
Mathis apareció posteriormente en American Psycho (2000), una adaptación cinematográfica de la novela homónima de Bret Easton Ellis de 1991. Actuó en Attraction (2000) y en The Simian Line (2001). Protagonizó la miniserie de televisión de TNT The Mists of Avalon (2001). Mathis actuó con Thomas Jane en The Punisher (2004). Tuvo un papel como invitada en la serie de televisión Lost de la ABC en el papel de Olivia Goodspeed. Interpretó a la hija de Jane Fonda en el espectáculo de Broadway “33 Variations”. Su película independiente Lebanon, PA tuvo su estreno mundial en el Festival de Cine SXSW de 2010. Apareció en una producción off-Broadway de la obra, Love, Loss, and What I Wore, en el Westside Theatre de Nueva York en octubre de 2011.
En 2013, Mathis interpretó a la psiquiatra Alice Calvert en la serie de televisión de la CBS Under the Dome, basada en una novela de Stephen King. En 2014, se unió al reparto de la serie dramática de terror de FX The Strain en el papel de Justine Feraldo, una concejala de Nueva York de Staten Island.
En 2019, Mathis apareció fuera de Broadway en el papel de Kate Conlee en Make Believe, una nueva obra de Bess Wohl puesta en escena en el Second Stage Theater. Michael Greif dirigió.
Su musical de 2020, Whisper House, se pospuso debido a la pandemia de COVID-19.