Den andra halvan av glykolysen (steg som frigör energi)
Sedan tidigare har glykolysen kostat cellen två ATP-molekyler och producerat två små sockermolekyler med tre kolväten. Båda dessa molekyler kommer att fortsätta genom den andra halvan av vägen, och tillräckligt med energi kommer att utvinnas för att betala tillbaka de två ATP-molekyler som användes som en första investering och producera en vinst för cellen på ytterligare två ATP-molekyler och två NADH-molekyler med ännu högre energi.
Steg 6. Det sjätte steget i glykolysen (figur 9.1.2) oxiderar sockret (glyceraldehyd-3-fosfat) och utvinner högenergielektroner som tas upp av elektronbäraren NAD+ och producerar NADH. Sockret fosforyleras sedan genom tillägg av en andra fosfatgrupp, vilket ger 1,3-bisfosfoglycerat. Observera att den andra fosfatgruppen inte kräver ytterligare en ATP-molekyl.
Här finns återigen en potentiell begränsande faktor för denna väg. Fortsättningen av reaktionen är beroende av tillgången på den oxiderade formen av elektronbäraren NAD+. NADH måste alltså kontinuerligt oxideras tillbaka till NAD+ för att detta steg ska kunna fortsätta. Om NAD+ inte finns tillgängligt saktar den andra halvan av glykolysen ner eller stannar upp. Om syre finns tillgängligt i systemet oxideras NADH lätt, om än indirekt, och de högenergielektroner från vätet som frigörs i denna process används för att producera ATP. I en miljö utan syre kan en alternativ väg (fermentering) ge oxidation av NADH till NAD+.
Steg 7. I det sjunde steget, som katalyseras av fosfoglyceratkinas (ett enzym som fått sitt namn efter den omvända reaktionen), donerar 1,3-bisfosfoglycerat en energirik fosfat till ADP och bildar en molekyl ATP. (Detta är ett exempel på fosforylering på substratnivå.) En karbonylgrupp på 1,3-bisfosfoglycerat oxideras till en karboxylgrupp och 3-fosfoglycerat bildas.
Steg 8. I det åttonde steget flyttas den återstående fosfatgruppen i 3-fosfoglycerat från det tredje kolet till det andra kolet, vilket ger upphov till 2-fosfoglycerat (en isomer av 3-fosfoglycerat). Det enzym som katalyserar detta steg är ett mutas (isomeras).
Steg 9. Enolas katalyserar det nionde steget. Detta enzym får 2-fosfoglycerat att förlora vatten från sin struktur; detta är en dehydreringsreaktion, vilket resulterar i bildandet av en dubbelbindning som ökar den potentiella energin i den återstående fosfatbindningen och producerar fosfenolpyruvat (PEP).
Steg 10. Det sista steget i glykolysen katalyseras av enzymet pyruvatkinas (enzymet har i detta fall fått sitt namn efter den omvända reaktionen av pyruvatets omvandling till PEP) och resulterar i produktion av en andra ATP-molekyl genom fosforylering på substratnivå och föreningen pyruvinsyra (eller dess saltform, pyruvat). Många enzymer i enzymatiska vägar är namngivna efter de omvända reaktionerna, eftersom enzymet kan katalysera både framåtriktade och omvända reaktioner (dessa kan ursprungligen ha beskrivits genom den omvända reaktionen som äger rum in vitro, under icke-fysiologiska förhållanden).
Nettoreaktionen vid omvandlingen av glukos till pyruvat är:
Tyvärr genereras alltså två ATP-molekyler vid omvandlingen av glukos till två pyruvatmolekyler.
Notera att den energi som frigörs vid den anaeroba omvandlingen av glukos till två molekyler pyruvat är -21 kcal mol-1 (- 88 kJ mol-1).