Ammoniumacetatbuffertar kan orsaka olika problem i laboratoriet. Två vanliga problem är överraskande ökningar av HPLC-MS-baktryck när man startar instrumentet efter förvaring över natten och svårigheter med MS-känsligheten.
Ökat instrument-baktryck vid användning av ammoniumacetat (och ammoniumformiat) är ett vanligt problem som man finner på kromatografiforum, särskilt när instrumentet stått över natten eller vid de första körningarna varje dag. Höglösliga vattenbuffertar kan orsaka en hel del huvudbry. De blir problematiska i praktisk användning och blockerar kapillärer, förkolonner och analytiska kolonnändar.
Dessa problem beror alltid på att man missförstått buffertarnas löslighet i blandade organiska vattenmedier. Detta kan övervinnas med hjälp av de data som visas i figur 1.
Figur 1: Löslighet för fem buffertar i blandningar med acetonitril. (Anpassat med tillstånd från Ref. 1)
Figur 1 visar tydligt att lösligheten för ammoniumacetat i binära blandningar som innehåller mer än 90 % acetonitril blir alltmer begränsad i löslighet och helt olöslig i 100 % acetonitril. Medan 20 mM ammoniumacetat är löslighetsgränsen vid 90 % acetonitril, sjunker denna gräns kraftigt till 10 mM ammoniumacetat (en populär buffertkoncentration som används vid LC-MS-tillämpningar) vid 95 % acetonitrilblandningar. Överskridande av dessa löslighetsgränser resulterar i en grumlig vätska på grund av den fina ammoniumacetatutfällningen i lösningen. Detta kan blockera kapillärer och kolonnfriter och orsaka en ökning av systemets mottryck. Det bör också noteras att uppgifterna i figur 1 har tagits fram med hjälp av en buffert av hög kvalitet – lösligheten kommer att minska om reagenser av lägre kvalitet (renhet) för buffersalt används. Undvik att försöka lösa upp ammoniumacetat i ren acetonitril, även om lösningen då kan få vatten tillsatt. Även om det till en början kan verka som om bufferten är löslig kommer den snabbt att falla ur lösningen (figur 2).
Figur 2: Ammoniumacetatrester som bildas när man “löser” ammoniumacetat i acetonitril, följt av tillsättning av vatten för att uppnå det erforderliga förhållandet mellan organisk och vattenhaltig substans i eluenten. (Fotografiet är en artighet av dr. Paul Ferguson, Astra Zeneca, UK).
I en typisk HPLC-gradient med omvänd fas är detta kanske inte ett så stort problem, såvida inte gradienten förstås går till >90% acetonitril. Det finns dock andra överväganden, t.ex. de relativa procentsatserna av organiskt lösningsmedel som den vattenhaltiga bufferten kan stöta på vid blandning med hjälp av låg- eller högtrycksblandningssystem, vid insprutning av prover som är lösta i höga procentsatser acetonitril eller, i värsta fall, när systemen spolas med 100 % acetonitril för att avlägsna kolonnkontaminanter eller för förvaring över natten.
Det finns ytterligare ett övervägande, när man använder 100 % acetonitril för kolonnförvaring, att stora pH-förskjutningar kan inträffa i 100 % organiska lösningsmedel och man måste vara uppmärksam på om dessa pH-förskjutningar kan föra kolonnförvaringens pH-värde in i ett område där upplösning av kiseldioxidmatrisen kan vara möjlig, vilket leder till att det bildas “fines” i kolonnen, vilket i slutändan kommer att resultera i kolonnblockering (vid höga pH-värden) eller strippning av liganderna i den bundna fasen (vid låga pH-värden).
Ammoniumacetat som buffert
Många valde att använda ammoniumacetat som buffert, särskilt när MS-detektion används, på grund av dess inneboende flyktighet och låga benägenhet för kontaminering av API-källor. Vi måste dock vara uppmärksamma på denna begränsade löslighet och anpassa vår HPLC-praxis därefter. Förstå om användningen av ammoniumacetat är lämplig för experimentet och om en buffert faktiskt är nödvändig. Kraven för användning och det lämpliga valet och koncentrationen av en buffert är ofta missförstådda. Ammoniumacetat är ett exempel för att undersöka användningen och missbruket av detta mycket omtyckta buffertsystem.
Buffertar krävs för att motstå små förändringar i pH (främst i eluenten) och för att se till att HPLC-kolonnen förblir i ett konstant laddningstillstånd (främst joniseringstillståndet hos kvarvarande silanolarter på kiseldioxidhållarens yta). Förändringar i pH kan orsaka problem med retentionstidsstabilitet, toppform och (vid användning av Electrospray MS) instrumentets känslighet. Typiskt sett kommer den största “utmaningen” för systemets pH-värde från blandningen av provspädningsmedlet med eluenten i de anslutande komponenterna mellan injektorn och HPLC-kolonnen (eller förkolonnen) och vid kolonnhuvudet. Om provutspädningsmedlet har ett annat pH kan analyten (eller en del av analytens molekyler) ändra joniseringstillstånd och kromatografera annorlunda eller reagera annorlunda i MS-gränssnittet som ett resultat av detta. Det är dock viktigt att förstå kemin i vår analysmetod för att kunna göra kritiska val av typ och koncentration av buffert. Analytenkoncentrationerna och mängden kolonnyta som kräver pH-kontroll är tillräckligt låga för att endast en mycket låg koncentration av buffert behövs för att bibehålla reproducerbara retentionstider, acceptabel toppform och detektionskänslighet.
Figur 3 visar i vilka situationer ammoniumacetat kan vara till nytta i både kromatografi och masspektrometri.
Figur 3: Variation av buffertkapaciteten för vattenhaltig ammoniumacetatlösning (10mM) med olika proportioner av acetonitril (%) (Anpassat med tillstånd från Ref. 2)
I huvudsak finns det två buffertområden när 10 mM ammoniumacetat tillsätts till vår eluentlösning och antingen utspädd ammoniak eller myrsyra används för att justera pH. Utan tillsats av syran eller basen kommer lösningen att ha mycket liten buffertkapacitet.
I 100 % vattenlösning ligger buffertarnas pKa-värden runt 4,8 och 9,5. Bufferten används bäst runt +/- 1 pH-enhet från buffertens pKa, där buffertkapaciteten minskar till cirka 66 %. Vid 2 pH-enheter från buffertpKa minskar buffertkapaciteten till cirka 5 %. För en ammoniumacetatbuffert i vatten bör pH-värdet för den eluent som används för separation vara 3,8-5,8 när myrsyra används som pH-modifierare och 8,5-10,5 när ammoniak används för att justera pH-värdet för eluenten. Varning: När acetonitril tillsätts i systemet ändras detta arbetsområde och det användbara pH-området blir 5,2-7,2 eller 7,9-9,9 vid 60 % acetonitril. Vid gradientseparation kommer buffersystemets pKa att förändras konstant. Systemets pKa vid startgradientsammansättningen används för att uppskatta buffertens användbarhet för separationen.
Var dessa pH-områden tillräckliga för att undvika förändringar i omfattningen av analytens jonisering eller kolonnens protonationsförändringar? Det är nyckelfrågan.
För MS-detektion kommer jonogena analyter i joniserad form att resultera i god detektionskänslighet, samtidigt som man hanterar retention i omvänd fas genom ett klokt val av stationär fas och typ och sammansättning av organiskt lösningsmedel. Om analyten är fullständigt joniserad vid de pH-områden som föreslås ovan (och i figur 3) kommer det att ge goda kromatografiska och detektionsresultat. Observera i figur 1 att systemets buffertkapacitet minskar när acetonitril tillsätts, och att buffertkapaciteten sjunker till 30 % av vattenvärdet vid 60 % acetonitril. Huvudprincipen när det gäller buffertanvändning i LC-MS är att använda så lite som möjligt för att bibehålla retentionstidsreproducerbarhet, acceptabel toppform och detektorkänslighet. Koncentrationen av buffert kommer direkt att påverka mängden jonundertryckning och därmed kommer metodens känslighet att påverkas direkt. För att bibehålla god buffertkapacitet vid lägre buffertkoncentrationer strävar vi ofta efter att arbeta inom +/- 0,5 enheter av buffrets pKa.
Tabell 1 visar de rekommenderade pH-områden där ammoniumacetatbuffertar kommer att vara användbara.
| % MeCN | Maximalt buffertkapacitetsområde (ättiksyra/acetat) | Maximalt buffertkapacitetsområde (ammonium/ammoniak) | Buffertkapacitet (% i förhållande till 100 % Aq-lösning) |
| 0 | 4.2 – 5.2 | 9.0 – 10.0 | 100 |
| 20 | 4.7 – 5.7 | 8.7 – 9.7 | 80 |
| 40 | 5.0 – 6.0 | 8.5 – 9.5 | 50 |
| 60 | 5.6 – 6.6 | 8.3 – 9.3 | 30 |
Tabell 1: Rekommenderade pH-arbetsområden och indikativa relativa buffertkapaciteter för 0,1 mM ammoniumacetat (aq) / acetonitril eluentsystem.
Använd buffertområdena från tabell 1 för att välja det pH-värde i eluenten där analyten bör joniseras till 100 %. Observera att den buffertkoncentration som används för att härleda dessa siffror är 0,1mM – ett populärt val av buffertkoncentration vid användning av MS-detektion. För basiska analyter är ättiksyra/acetat-buffersystemet vanligt, och eluentens pH-värde ligger vanligen långt under de basiska analyternas pKa, vilket säkerställer att de ständigt protoneras. Samma sak kan gälla för sura analyter med ammonium/ammoniak-systemet, där alla sura analyter bör vara helt deprotonerade. Detta kommer att säkerställa att retentionstiderna är stabila, att toppformerna är sunda och att MS-känsligheten optimeras ur ett metodkemiskt perspektiv.
Det finns stora luckor i de effektiva buffertområdena för ammoniumacetatbaserade eluenter. Det vill säga, vid en 20-procentig acetrontril eluentsammansättning (eller en startgradientsammansättning på 20 procent acetonitril) är det troligt att buffertkapaciteten är lägre (högre buffertkoncentrationer måste användas) med ett pH-värde för eluenten som är lägre än 4,2, mellan pH 5,2 och 9,0 eller högre än 10,0. Det finns andra metoder där pH-värdet för eluenten justeras utanför dessa rekommenderade intervall när ammoniumacetatbuffertar används. Överväg att använda ett annat buffertsystem – systemet med format/myrsyra är ett populärt val vid eluent-pH-värden under 4,2.
Bör en buffert alltid användas?
Om eluent-pH ligger långt ifrån analytens pKa kommer små förändringar i eluent-pH att ha en försumbar effekt på graden av jonisering av analyten. Under dessa omständigheter kan det vara onödigt att använda en buffert. Till exempel har ättiksyra (liksom myrsyra, trifluoroättiksyra och difluoroättiksyra) en betydande “självbuffrande” kapacitet vid lågt pH och ger den basiska analyten pKa >2 pH-enheter högre och den sura analyten pKa
Detta förutsätter att basiska analyter analyseras med hjälp av ett surt eluentsystem och sura analyter med ett mer basiskt eluentsystem-pH för att säkerställa full jonisering och god känslighet för elektrospray MS. Om man har problem med instrumentets mottryck, instabilitet i retentionstiden eller MS-detektionskänslighet kan det vara värt att överväga om ett buffertsalt överhuvudtaget behövs. En klok användning av myrsyra, ättiksyra eller ammoniaklösning kan mycket väl lösa eventuella problem.
Hursomhelst, ta dig tid att förstå metodens kemi med avseende på analytens pKa, det krävda pH-värdet för eluenten och valet av buffertsystem som används för att uppnå och bibehålla detta pH-värde i systemet.
För dem som inte har information om analytens pKa finns det ett antal kostnadsfria program som gör ett rimligt jobb med att förutsäga analytens pKa baserat på struktur. De som används flitigt i våra laboratorier är:
- ChemSketch – https://www.acdlabs.com/resources/freeware/chemsketch/
- MarvinSketch – https://chemaxon.com/products/marvin
Om du vill ha en djupare förståelse för buffertar och deras användning inom HPLC och LC-MS hänvisar vi till artiklarna i referenserna 3-6.
Solubility of Buffers in Aqueous-Organic Eluents for Reversed-Phase Liquid Chromatography, Adam P. Schellinger och Peter W. Carr, LCGC North America Volume 22 Number 6 June 2004
Buffer Considerations for LC and LC-MS, Xavier Subirats, Elisabeth Bosch, and Marti Rosés, LCGC North America Volume 27 Number 11 November 2009
Mobile-Phase Buffers, Part I – The Interpretation of pH in Partially Aqueous Mobile Phases, LCGC North America Volume 20 Number 11 November 2002
Mobile-Phase Buffers, Part II – Buffer Selection and Capacity, LCGC North America Volume 20 Number 12 December 2002
Mobile-Phase Buffers, Part III – Buffer Selection and Capacity, LCGC North America Volume 21 Number 1 January 2003
Mobile Phase Buffers in LC: Effect of Buffer Preparation Method on Retention Repeatability, LCGC North America Volume 37, Issue 7, July 2019