3.1 Endogena fiskenzymer
Som diskuterats ovan finns olika proteolytiska enzymer i fiskens inälvor, matsmältningsapparat och muskelvävnad.
De viktigaste endogena proteinaserna i ansjovis var trypsinliknande proteinas, pepsin, chymotrypsin, elastas och aminopeptidas (Martinez & Serra, 1989; Siringan, Raksakulthai, & Yongsawatdigul, 2006). De tre viktigaste enzymerna i matsmältningen är trypsin, chymotrypsin och pepsin (de la Parra, Rosas, Lazo, & Viana, 2007). Pepsin finns vanligtvis i fiskens mage och är ett huvudenzym i matsmältningssaften (de la Parra et al., 2007). Trypsin finns i inälvor, pyloric caeca och mjälte (Kishimura, Hayashi, Miyashita, & Nonami, 2005, 2006; Kishimura et al., 2007; Klomklao et al., 2006). Hepatopankreas från fiskens och skaldjurens matsmältningsorgan innehåller både peptidas- och proteinasaktiviteter såsom aminopeptidas, gelatinolytiska proteaser, trypsin och chymotrypsin samt kollagenolytiska proteaser (Sriket, 2014).
Det konstaterades att de flesta lipolys- och proteolysaktiviteterna i samband med peda-bearbetning registrerades i tarmen, särskilt i början av jäsningsprocessen; aktiviteterna sjönk dock snabbt under processen (Irianto, 1990). Med tanke på att enzymer finns i inälvorna och matsmältningskanalen spelar urtagningen en viktig roll när det gäller att bestämma hastigheten och typen av enzymatisk nedbrytning. Fermenterade fiskprodukter som bearbetas med hjälp av hel fisk kommer att ha andra egenskaper än de som tillverkas med huvud och rensad fisk (Wheaton & Lawson, 1985). Den enzymatiska aktiviteten hos de flesta enzymer i inälvorna och matsmältningskanalen från fisk hade störst aktivitet vid nära neutrala pH-värden (Bougatef et al., 2007; Munilla-Moran & Saborido-Rey, 1996).
Castillo-Yañez, Pacheco-Aguilar, Garcia-Carreño och Toro (2004) isolerade ett surt proteolytiskt enzym, som tillhör klassen aspartiska proteaser, från inälvorna av sardiner. Enzymet liknar pepsin II från andra fiskarter och är stabilt vid pH 3-6 och 45 °C.
Pyloric caeca utgör de organ som är den största källan till alkaliska proteinaser. Ett trypsinliknande enzym som erhållits från pyloric caeca från torsk (G. morhua) hade en isoelektrisk punkt på 5,30 och 5,89 och var mycket lik aminosyrasammansättning till nötkreaturets trypsin, men skiljde sig åt genom att ha en högre relativ mängd sura aminosyror och en lägre mängd basiska aminosyror. Enzymet hydrolyserade även substrat av fiskprotein (Beirão, Mackie, Teixeira, & Damian, 2001).
Tre alkaliska proteinaser och två sura proteinaser isolerades från sardin. Var och en av de alkaliska proteinaserna hydrolyserade kasein snabbare än andra proteiner. Ett större alkaliskt proteinas (III) hydrolyserade sarkoplasmaproteiner från sardin fem gånger snabbare än andra alkaliska proteinaser. Var och en av två sura proteinaser hydrolyserade hemoglobin och myoglobin snabbare än andra proteiner. Efter förinkubation med 25 % NaCl var ett alkaliskt proteinas (III) och ett surt proteinas (II) stabila medan de andra proteinaserna blev instabila. De två proteinaserna, alkaliskt proteinas III och surt proteinas II, var också stabila i tre månader efter det att produktionen av fisksås påbörjats. Den proteolytiska aktiviteten hos vart och ett av de alkaliska och de sura proteinaserna hämmades kraftigt av mer än 15 % NaCl; minsta möjliga hämning observerades dock när sardinmuskelproteiner användes som substrat (Noda, Van, Kusakabe, & Murakami, 1982).
Två aminopeptidaser (I och II) extraherades från avfettade inre organ från sardin och renades med hjälp av DEAE-cellulosakromatografi, gelfiltrering på Sephadex G-200 och isoelektrisk fokusering. De slutliga preparaten av enzymerna I och II bedömdes som nästan homogena genom polyakrylamidgelelektrofores. Molekylvikten för enzymerna I och II bestämdes genom gelfiltrering till 370 000 respektive 320 000. De isoelektriska punkterna var 4,1 (I) respektive 4,8 (II). Båda enzymerna hämmades av EDTA och aktiverades av Co++. Bestatin kunde hämma enzym I men inte enzym II. Enzymerna I och II hydrolyserade snabbt inte bara syntetiska substrat som innehåller alanin eller leucin utan även di-, tri- och tetraalanin. Baserat på alla dessa egenskaper liknar sardinaminopeptidaser mänskligt alaninaminopeptidas. Enzym I behöll mer än 70 % av sin ursprungliga aktivitet i 15 % NaCl, vilket tyder på att enzymet deltar i hydrolyseringen av fiskproteiner och peptider under produktionen av fisksås (Vo Van, Kusakabe, & Murakami, 1983).
Aktiviteterna hos alkaliska och sura proteinaser jämfördes med trypsin och pepsin från nötkreatur och visade att liksom trypsin från nötkreatur hydrolyserade det alkaliska proteinaset från sardinens pyloric caecaka kasein effektivare än andra proteinsubstrat (Noda et al, 1982).
Muskelvävnadsenzymer, särskilt kathepsiner, peptidaser, transaminaser, amidaser, aminosyradekarboxylaser, glutamidehydrogenaser och besläktade enzymer, återfinns alla i fiskens muskelvävnad (Chaveesuk, 1991), och dessa enzymer, särskilt trypsin, chymotrypsin och kathepsin, är involverade i proteinhydrolysen under fermentering av fisksås (Fernandes, 2016). Muskelvävnadens enzymer är mestadels lokaliserade i cellerna. Å andra sidan är matsmältningsenzymer exocellulära utsöndringar. Även om vissa studier visade att muskelvävnadsenzymer har en optimal aktivitet vid neutralt pH, informerar de flesta rapporter att låga pH-värden påskyndar muskelvävnadsenzymaktiviteterna. De flesta fermenterade fiskprodukter bearbetas vid pH över 4, med undantag för fiskensilage och vissa fermenterade fiskprodukter. Följaktligen är de flesta muskelvävnadsenzymer faktiskt inte vid optimalt pH-tillstånd (Mackie et al., 1971).
Den partiella karakteriseringen av kathepsin B från muskeln av taggmakrill visade på liknande egenskaper som andra kathepsin BS. Det optimala pH-värdet för kathepsinet var 5 med en optimal temperatur på 50 °C. Aktiviteten hämmades av E-64, CA-074 och chymostatin (Yoshida et al., 2015).
Maximala enzymaktiviteter kan uppnås genom att använda hel fisk inklusive huvud och inälvor. Minsta enzymaktivitet uppnås tvärtom när huvudlös och rensad fisk används för att framställa fermenterade fiskprodukter. Samtidigt kan man få en medelhög enzymaktivitet om man tar bort inälvorna när som helst efter det att fisken har fångats för att möjliggöra en viss spridning av inälvsenzymerna till vävnaderna (Owens & Mendoza, 1985).
I saltad fisk beskrivs mognaden av tre hypoteser. Dessa är (1) mikrobiologisk teori, (2) autolytisk teori och (3) enzymteori. Enligt den mikrobiologiska teorin producerar mikroorganismerna de viktiga aktiva enzymerna, och dessa enzymer tränger in i köttet och bidrar till mognadsprocessen. Den autolytiska teorin beskriver att mognaden är ett resultat av aktiviteten hos enzymer i musklerna eller andra vävnader, eller i mag-tarmkanalen. Slutligen förklarar enzymteorin att mognaden av saltad fisk sker under påverkan av vissa enzymer, nämligen de som finns i muskelvävnaden, de som finns i fiskens tarmkroppsorgan samt de som produceras av mikroorganismer (Mackie et al., 1971).
Vid mognadslagring av ansjovis hittades den maximala autolytiska aktiviteten hos indisk ansjovis (Stolephorus indicus) vid 60°C. Den autolytiska aktiviteten minskade med ökad NaCl-koncentration. Råextrakt uppvisade ett optimalt pH vid 8,5-9,5. Trypsinliknande proteinaser var de dominerande proteinaserna i råextraktet. Proteinaser från indisk ansjovis kan delta i proteinhydrolysen under fermentering av fisksås. Därför kan inkubering av indisk ansjovis vid 60 °C och i 10 % NaCl under en viss tid före fullsaltning med 25 % NaCl vara ett effektivt sätt att påskynda fermenteringsprocessen av fisksås (Siringan et al., 2006).