AFLATOXINER : Förekomst och hälsorisker

Aflatoxiner är giftiga metaboliter som produceras av vissa svampar i/på livsmedel och foder. De är förmodligen de mest kända och mest intensivt undersökta mykotoxinerna i världen. Aflatoxiner har förknippats med olika sjukdomar, t.ex. aflatoxikos, hos boskap, husdjur och människor i hela världen. Förekomsten av aflatoxiner påverkas av vissa miljöfaktorer, och därför varierar omfattningen av kontaminering beroende på geografiskt läge, jordbruks- och agronomiska metoder och råvarornas mottaglighet för svampangrepp under perioder före skörd, lagring och/eller bearbetning. Aflatoxiner har fått större uppmärksamhet än andra mykotoxiner på grund av deras påvisade potentiellt cancerframkallande effekt hos mottagliga laboratoriedjur och deras akuta toxikologiska effekter hos människor. Eftersom man inser att absolut säkerhet aldrig kan uppnås har många länder försökt att begränsa exponeringen för aflatoxiner genom att införa reglerande gränser för varor som är avsedda att användas som livsmedel och foder.

Inledning

Inom 1960 dog mer än 100 000 unga kalkoner på fjäderfägårdar i England inom loppet av några månader av en till synes ny sjukdom som kallades “Turkey X disease” . Det visade sig snart att problemet inte var begränsat till kalkoner. Ankungar och unga fasaner drabbades också och det uppstod stor dödlighet.

En noggrann undersökning av de tidiga utbrotten visade att de alla var förknippade med foder, nämligen brasilianskt jordnötsmjöl. En intensiv undersökning av det misstänkta jordnötsmjölet genomfördes och man fann snabbt att detta jordnötsmjöl var mycket giftigt för fjäderfä och ankungar med symtom som var typiska för Turkey X-sjukan.

Spekulationer som gjordes under 1960 om toxinets karaktär tydde på att det kunde vara av svampiskt ursprung. Den toxinproducerande svampen identifierades faktiskt som Aspergillus flavus (1961) och toxinet fick namnet Aflatoxin på grund av sitt ursprung (A.flavis–>Afla).

Denna upptäckt har lett till en växande medvetenhet om de potentiella riskerna med dessa ämnen som föroreningar i livsmedel och foder och som kan orsaka sjukdom och till och med död hos människor och andra däggdjur. Studier som sammanfattas i följande avsnitt visar att aflatoxiner i första hand produceras av vissa stammar av A. Flavus och av de flesta, om än inte alla stammar av A. parasiticus , samt besläktade arter, A. nomius och A. niger. Dessutom visade dessa undersökningar att det finns fyra stora aflatoxiner: B1, B2, G1 och G2 samt två ytterligare metaboliska produkter, M1 och M2, som är av betydelse som direkta föroreningar av livsmedel och foder. Aflatoxinerna M1 och M2 isolerades först från mjölk från lakterande djur som utfodrats med aflatoxinpreparat, därav beteckningen M. Beteckningen B för aflatoxinerna B1 och B2 är ett resultat av att de uppvisar blå fluorescens under UV-ljus, medan beteckningen G avser den gulgröna fluorescensen hos de relevanta strukturerna under UV-ljus. Dessa toxiner har mycket likartade strukturer och bildar en unik grupp av högt syresatta, naturligt förekommande heterocykliska föreningar. Deras molekylformler som fastställts genom elementära analyser och masspektrometriska bestämningar är:

• B1 : C17 H12 O6
• B2 : C17 H14 O6
• G1 : C17 H12 O7
• G2 : C17 H14 O7

Aflatoxiner B2 och G2 fastställdes som dihydroxiderivat av B1 respektive G1. Aflatoxin M1 är 4-hydroxiaflatoxin B1 och aflatoxin M2 är 4-dihydroxiaflatoxin B2.

Förekomst

I råa jordbruksprodukter :

Aflatoxiner förekommer ofta i grödor på fältet före skörd. Kontaminering efter skörd kan ske om torkningen av grödan försenas och under lagring av grödan om vattnet tillåts överskrida kritiska värden för mögeltillväxt. Insekts- eller gnagarangrepp underlättar mögelintrång i vissa lagrade varor.

Aflatoxiner upptäcks ibland i mjölk, ost, majs, jordnötter, bomullsfrön, nötter, mandlar, fikon, kryddor och en rad andra livsmedel och foder. Mjölk, ägg och köttprodukter kontamineras ibland på grund av att djuren konsumerar aflatoxinförorenat foder. De varor som löper störst risk för aflatoxinförorening är dock majs, jordnötter och bomullsfrö.

I bearbetade livsmedel :

Majs är förmodligen den produkt som ger upphov till störst oro i hela världen, eftersom den odlas i klimat där det är troligt att den ständigt är kontaminerad med aflatoxiner och eftersom majs är baslivsmedel i många länder. De förfaranden som används vid bearbetningen av majs bidrar dock till att minska kontamineringen av den resulterande livsmedelsprodukten. Detta beror på att även om aflatoxiner är stabila eller måttligt stabila i de flesta livsmedelsprocesser är de instabila i processer som t.ex. de processer som används för att göra tortillas som använder alkaliska förhållanden eller oxiderande steg. Aflatoxinförorenad majs och bomullsfrömjöl i mjölkransoner har lett till att mjölk och mjölkprodukter, inklusive fettfri torrmjölk, ost och yoghurt, har förorenats med aflatoxin M1.

Faktorer som gynnar produktionen av aflatoxin

Svamptillväxt och aflatoxinförorening är en följd av interaktioner mellan svampen, värden och miljön. Den lämpliga kombinationen av dessa faktorer bestämmer infestationen och koloniseringen av substratet samt typen och mängden aflatoxin som produceras. Det krävs dock ett lämpligt substrat för svampens tillväxt och efterföljande toxinproduktion, även om man inte vet exakt vilken eller vilka faktorer som inleder toxinbildningen. Vattenstress, hög temperatur och insektsskador på värdväxten är viktiga faktorer som är avgörande för mögelangrepp och toxinproduktion. På samma sätt har specifika tillväxtstadier för grödor, dålig bördighet, hög grödtäthet och ogräskonkurrens förknippats med ökad tillväxt av mögel och toxinproduktion. Aflatoxinbildningen påverkas också av andra mögelsvampar eller mikrober. Exempelvis gynnas kontaminering av jordnötter och majs med aflatoxiner före skörden av höga temperaturer, långvarig torka och hög insektsaktivitet, medan produktion av aflatoxiner på majs och jordnötter efter skörden gynnas av varma temperaturer och hög luftfuktighet.

Aflatoxikos och djurhälsa

Aflatoxikos är främst en hepatisk sjukdom. De enskilda djurens känslighet för aflatoxiner varierar avsevärt beroende på art, ålder, kön och näring. Aflatoxiner orsakar leverskador, minskad mjölk- och äggproduktion, återkommande infektioner till följd av nedsatt immunitet (t.ex. salmonellos) samt embryotoxicitet hos djur som konsumerar låga koncentrationer via kosten. Även om unga djur av en art är mest mottagliga påverkas alla åldrar, men i olika grad för olika arter. Kliniska tecken på aflatoxikos hos djur är bl.a. gastrointestinal dysfunktion, minskad reproduktivitet, minskad foderutnyttjande och effektivitet, anemi och gulsot. Djur som ammar kan påverkas till följd av omvandlingen av aflatoxin B1 till metaboliten aflatoxin M1 som utsöndras i mjölken hos mjölkkor.

Aflatoxinernas framkallande av cancer har studerats ingående. Aflatoxin B1, aflatoxin M1 och aflatoxin G1 har visat sig orsaka olika typer av cancer hos olika djurarter. Det är dock endast aflatoxin B1 som av Internationella byrån för cancerforskning (IARC) anses ha gett tillräckliga belägg för att vara cancerframkallande i försöksdjur för att identifieras som cancerframkallande.

Aflatoxiner och människors hälsa

Människor exponeras för aflatoxiner genom att konsumera livsmedel som är förorenade med produkter från svamptillväxt. Sådan exponering är svår att undvika eftersom det inte är lätt att förhindra svamptillväxt i livsmedel. Även om kraftigt kontaminerade livsmedel inte tillåts på marknaden i de utvecklade länderna finns det fortfarande en oro för eventuella negativa effekter av långvarig exponering för låga halter av aflatoxiner i livsmedel.

De förhållanden som ökar sannolikheten för akut aflatoxikos hos människor är bland annat begränsad tillgång till livsmedel, miljöförhållanden som gynnar svamputveckling i grödor och råvaror och avsaknad av regleringssystem för övervakning och kontroll av aflatoxin.

Aflatoxiner, särskilt aflatoxin B1, är starkt cancerframkallande hos vissa djur, och därför är man intresserad av effekterna på människor av långvarig exponering för låga nivåer av dessa viktiga mykotoxiner. År 1988 placerade IARC aflatoxin B1 på listan över cancerframkallande ämnen för människor. Detta stöds av ett antal epidemiologiska studier som gjorts i Asien och Afrika och som visat att det finns ett positivt samband mellan aflatoxiner i kosten och levercellscancer (LCC). Dessutom kan aflatoxinrelaterade sjukdomar hos människor påverkas av faktorer som ålder, kön, näringsstatus och/eller samtidig exponering för andra orsaker, t.ex. virushepatit (HBV) eller parasitangrepp.

Nya analysmetoder för aflatoxiner i livsmedel och foder

Provtagning och provberedning :

Provtagning och provberedning är fortfarande en betydande felkälla vid analytisk identifiering av aflatoxiner. Systematiska metoder för provtagning, provberedning och analys är därför absolut nödvändiga för att bestämma aflatoxiner på parts-per-billion-nivå. I detta avseende har särskilda planer utvecklats och testats noggrant för vissa varor, t.ex. majs, jordnötter och trädnötter, och provtagningsplaner för vissa andra varor har utformats efter dessa planer. Gemensamt för alla provtagningsplaner är att hela primärprovet måste malas och blandas så att analysdelen har samma toxinhalt som det ursprungliga provet.

Fasta fas-extraktion :

Alla analysmetoder omfattar tre steg: extraktion, rening och bestämning. Den viktigaste förbättringen av reningssteget på senare tid är användningen av extraktion i fast fas.
Provextrakt rengörs före instrumentell analys (tunnskikts- eller vätskekromatografi) för att avlägsna samextraherade material som ofta stör bestämningen av målanalyter.

Tunnskiktskromatografi :

Tunnskiktskromatografi (TLC), även känd som plattbäddskromatografi eller planarkromatografi, är en av de mest använda separationsteknikerna vid aflatoxinanalys. Sedan 1990 har den betraktats som AOAC:s officiella metod och den bästa metoden för att identifiera och kvantifiera aflatoxiner vid nivåer så låga som 1 ng/g. TLC-metoden används också för att kontrollera resultaten med nyare, snabbare tekniker.

Vätskekromatografi :

Vätskekromatografi (LC) liknar TLC i många avseenden, bland annat när det gäller analyter, stationär fas och mobil fas. Flytande kromatografi och TLC kompletterar varandra. Det är inte ovanligt att en analytiker använder TLC som förarbete för att optimera LC-separationsförhållandena.
Vätskekromatografiska metoder för bestämning av aflatoxiner i livsmedel omfattar LC i normalfas (NPLC), LC i omvänd fas (RPLC) med derivatisering före eller före kolumnen (BCD), RPLC följt av derivatisering efter kolumnen (PCD) och RPLC med elektrokemisk detektion.

Immunokemiska metoder :

Tunnskiktskromatografi och LC-metoder för bestämning av aflatoxininer i livsmedel är arbetskrävande och tidskrävande. Ofta kräver dessa tekniker kunskap och erfarenhet av kromatografiska tekniker för att lösa separations- och interferensproblem. Tack vare framsteg inom biotekniken finns nu mycket specifika antikroppsbaserade tester på marknaden som kan identifiera och mäta aflatoxiner i livsmedel på mindre än 10 minuter. Dessa tester bygger på de monoklonala eller polyklonala antikropparnas affinitet för aflatoxiner. De tre typerna av immunokemiska metoder är radioimmunoassay (RIA), enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) och immunoaffinitetskolonnassay (ICA).

Bekräftelse av aflatoxinernas identitet :

Och även om analysmetoderna kan bestå av olika extraktions-, renings- och kvantifieringssteg bör resultaten av analyserna med sådana metoder vara likartade när metoderna tillämpas korrekt. Eftersom tillförlitligheten hos de kvantitativa uppgifterna inte ifrågasätts är det problem som återstår att lösa att bekräfta aflatoxinernas identitet. De bekräftelsemetoder som används omfattar antingen kemisk derivatisering eller masspektrometri (MS).

Säkerhetsfrågor vid hantering av mögligt spannmål och aflatoxiner :

Säkerheten är en nyckelfråga för forskare som arbetar med aflatoxiner.Åtgärder måste vidtas för att minimera exponeringen för toxinerna och för de producerande mikroorganismerna Aspergillus flavus och Aspergillus parasiticus. Ett säkerhetsprogram bör upprättas som uppfyller kraven i Laboratory Standard of the Occupational Safety and Health Administration (1990) och riktlinjerna från National Institutes of Health (1981) om användning av kemiska cancerframkallande ämnen.

Övervakningsmetoder för bedömning av människors exponering för aflatoxiner

Under de senaste åren har ny teknik utvecklats som mer exakt övervakar individuell exponering för aflatoxiner. Särskild uppmärksamhet har ägnats åt analysen av aflatoxin-DNA-addukter och albuminaddukter som surrogat för genotoxicitet hos människor. Autrup et al. (1983) var pionjär i användningen av synkron fluorescensspektroskopi för mätning av DNA-addukter av aflatoxin i urin. Urinprover som samlats in efter exponering för alfatoxiner visade sig innehålla 2,3-dihydroxy-2-(N7-guanyl)-3-hydroxyaflatoxin B1, trivialt känt som AFB-Gual . Wild et al. (1986) använde mycket känsliga immunoassays för att kvantifiera aflatoxiner i kroppsvätskor från människor. En enzymkopplad immunosorbentanalys (ELISA) användes för att kvantifiera aflatoxin B1 i intervallet 0,01 ng/ml till 10 ng/ml och validerades i urinprover från människor. Med hjälp av denna metod konstaterades att utsöndringen av aflatoxin-DNA-addukt i urinen var positivt korrelerad med intaget via kosten, och det större aflatoxin B1-DNA-addukt som utsöndras i urinen visade sig vara en lämplig mätare för att övervaka exponeringen för aflatoxin via kosten.

Kontroll och hantering av aflatoxiner

A- Reglerande kontroll:

Aflatoxiner anses vara oundvikliga föroreningar i livsmedel och foder, även om god tillverkningspraxis har följts. FDA har fastställt särskilda riktlinjer för acceptabla nivåer av aflatoxiner i livsmedel och djurfoder genom att fastställa åtgärdsnivåer som gör det möjligt att avlägsna partier som inte uppfyller kraven från handeln. Åtgärdsnivån för livsmedel är 20 ppb totala aflatoxiner, med undantag för mjölk som har en åtgärdsnivå på 0,5 ppb för aflatoxin M1. Åtgärdsnivån för de flesta foder är också 20 ppb. Det är emellertid mycket svårt att exakt uppskatta aflatoxinkoncentrationen i en stor mängd material på grund av den variation som är förknippad med testmetoderna. Därför kan den verkliga aflatoxinkoncentrationen i ett parti inte bestämmas med hundraprocentig säkerhet.

B- Strategier för avgiftning :

Eftersom kontaminering med aflatoxiner är oundviklig har det föreslagits ett stort antal strategier för att avgifta dem. Dessa omfattar fysiska separationsmetoder, termisk inaktivering, bestrålning, lösningsmedelsextraktion, adsorption från lösning, mikrobiell inaktivering och fermentering. Kemiska metoder för avgiftning används också som en viktig strategi för effektiv avgiftning:

Strukturell nedbrytning efter kemisk behandling :
En varierande grupp kemikalier har testats med avseende på deras förmåga att bryta ned och inaktivera aflatoxiner. Ett antal av dessa kemikalier kan reagera för att förstöra (eller nedbryta) aflatoxiner på ett effektivt sätt, men de flesta är opraktiska eller potentiellt osäkra på grund av att det bildas giftiga rester eller att produktens innehåll av näringsämnen och organoleptiska egenskaper störs. Två kemiska metoder för att avgifta aflatoxiner som har fått stor uppmärksamhet är ammoniakering och reaktion med natriumbisulfit.
Många studier ger belägg för att kemisk behandling genom ammoniakering kan vara en effektiv metod för att avgifta aflatoxinkontaminerad majs och andra råvaror. Mekanismen för denna verkan tycks inbegripa hydrolys av laktonringen och kemisk omvandling av moderföreningen aflatoxin B1 till många produkter som uppvisar kraftigt minskad toxicitet.
Natriumbisulfit har å andra sidan visat sig reagera med aflatoxiner (B1, G1 och M1) under olika förhållanden med avseende på temperatur, koncentration och tid för att bilda vattenlösliga produkter.

Modifiering av toxicitet genom kostkemikalier :
Toxiciteten hos mykotoxiner kan i hög grad påverkas av kostkemikalier som förändrar däggdjursystemens normala reaktioner på dessa ämnen.Ett varierande antal kemiska faktorer, inklusive näringskomponenter (t.ex. protein och fett i kosten, vitaminer och spårämnen), livsmedels- och fodertillsatser (t.ex. antibiotika och konserveringsmedel) samt andra kemiska faktorer kan interagera med effekterna av aflatoxiner hos djur.

Förändring av biotillgängligheten med hjälp av kemisorbenter för aflatoxiner :
En ny metod för att avgifta aflatoxiner är att tillsätta oorganiska sorbentmaterial, s.k. kemisorbenter, t.ex. natriumhydratkalciumaluminosilikat (HSCAS) i djurens foder. HSCAS har förmågan att binda och immobilisera aflatoxiner i djurens mag-tarmkanal, vilket leder till en betydande minskning av aflatoxinernas biotillgänglighet.

Aflatoxinernas ekonomiska konsekvenser

Den ekonomiska effekten av aflatoxiner som indirekt härrör från förluster av grödor och boskap samt indirekt från kostnaden för regleringsprogram som syftar till att minska riskerna för djurs och människors hälsa. FAO (Food and Agriculture Organization) uppskattar att 25 % av världens livsmedelsgrödor påverkas av mykotoxiner, av vilka de mest kända är aflatoxiner. De förluster för djur- och fjäderfäproducenter som orsakas av aflatoxinförorenat foder omfattar dödsfall och mer subtila effekter i form av nedsatt immunförsvar, minskad tillväxt och minskad fodereffektivitet. Andra negativa ekonomiska effekter av aflatoxiner är bland annat lägre avkastning på livsmedels- och fibergrödor.

Aflatoxinernas förmåga att orsaka cancer och relaterade sjukdomar hos människor, med tanke på deras till synes oundvikliga förekomst i livsmedel och foder, gör att förebyggandet och avgiftet av dessa mykotoxiner är en av de mest utmanande toxikologiska frågorna i dagsläget.

Anon. 1989. Mykotoxiner, ekonomiska risker och hälsorisker. Rådet för jordbruksvetenskap och teknik, rapport nr 116, s. 91.

Eaton, D.L. och Groopman, J.D. 1994. Aflatoxinernas toxikologi. AcademicPress, New York, s. 383-426.

Finley, J.W.,Robinson, S.F. och Armstrong, D.J. 1992. Food Safety Assessment, American Chemical Society, Washington, D.C., s. 261-275.

Goldbatt, L.A. 1969. Aflatoxin. Academic Press,New York. pp1-40.

Heathcote, J.G. and Hibbert, J.R. 1978. Aflatoxiner: Kemisk och biologisk aspekt. Elsevier, New York, s. 173-186.

Liener, I.E. 1969. Toxinkomponenter i vegetabiliska livsmedel. AcademicPress , New York. pp392-394.

Wyllie, T.D. and Morchause,L.G. 1978. Mycotoxin Fungi, Mycotoxins,Mycotoxicoses-An Encyclopedic Handbook.Vols.1,2, and 3.Marcel Dekker, Inc. Newyork.