Det övergripande målet med detta förfarande är att sekventiellt extrahera RNA och DNA från arkiverade formalinfixerade paraffininbäddade vävnadskärnor. Detta är ett protokoll för att skörda vävnadskärnor från vilka vi kommer att extrahera både RNA och DNA. Den främsta fördelen med detta protokoll är att det förbättrar utbytet av RNA och DNA från exakt riktade områden i vävnadsblocket.

Detta förfarande är till stor del utvecklat i arkiverade prostatacancervävnader. Det kan också tillämpas på andra typer av arkivvävnader. Den visuella demonstrationen av denna metod är kritisk eftersom vävnadskärnsteget inte är vanligt förekommande i forskningslaboratorier.

De flesta forskningslaboratorier använder istället tvärsnitt, vilket uttömmer vävnaderna snabbare och tillför betydande heterogenitet till provet. Börja med att granska mikroskopglaset och rita ut det område som är av intresse med en permanent tuschpenna med fin spets. Klipp sedan en bit paraffinfilm som är tillräckligt stor för att täcka det intressanta området på mikroskopglaset.

Placera sedan filmen stadigt på objektglaset och linda in filmen över kanterna för att förhindra att den glider. Använd en permanent tuschpenna med fin spets och rita av hela vävnaden och det intressanta området i vävnaden. Ta sedan bort filmen från objektglaset och överför den till motsvarande vävnadsblock.

Orientera filmen genom att vända eller rotera den så att konturerna av hela vävnaden matchar den observerade formen på vävnaden i blocket. Tryck filmsektionen stadigt mot blockets yta för att förhindra att den glider. Gör med den permanenta markörens spets grunda men synliga intryckningar längs konturerna av den intressanta regionen och ta sedan bort filmen.

Rengör sedan receptorstansen från stanssatsen på 0,6 millimeter genom att dränka spetsen i ett mikrocentrifugeringsrör på 1,5 milliliter som innehåller en milliliter blekmedel och skjut stansen upp och ner flera gånger. Upprepa tvätten med röret som innehåller 70 procent etanol och sedan vatten. Tryck nu in den rengjorda stansen i det intressanta området till ett djup av tre millimeter och dra tillbaka.

Framställ kärnan i ett mikrocentrifugeringsrör med låg bindningsgrad genom att trycka ut den ur stansen med stylus. Tillsätt en milliliter xylen till mikrofuge-rören som innehåller vävnadskärnorna och virvela kraftigt i tio sekunder. Placera sedan i ett värmeblock inställt på 50 grader Celsius i tre minuter.

Efter inkubationen centrifugera i två minuter i rumstemperatur med högsta hastighet. Efter centrifugeringen placeras kärnorna på is i fem minuter för att stelna vaxresterna. Ta nu försiktigt bort det paraffin som samlats runt menisken tillsammans med supernatanten med hjälp av en pipettspets.

Nu upprepar du xylenbehandlingen. Efter att ha tagit bort paraffin-xylenblandningen, tillsätt en milliliter 100-procentig etanol och vortexa kraftigt i tio sekunder. Efter att ha centrifugerat med högsta hastighet i två minuter kastar du försiktigt etanolen.

Upprepa etanoltvätten en gång till innan du påbörjar homogeniseringen. Resuspendera de deparaffiniserade kärnorna i 700 mikroliter 100 procent etanol före homogeniseringen. Använd en motoriserad vävnadshomogenisator på medelhög inställning för att mala kärnorna till fina partiklar.

Grundlig homogenisering av vävnadskärnorna krävs för optimalt utbyte av DNA och RNA. Fyll därefter separata 15 milliliterrör med cirka tio milliliter blekmedel, RNase-neutraliserande lösning och 70 procent etanol. Efter homogeniseringen av provet tvättar du homogenisatorsonden i var och en av rengöringslösningarna i tur och ordning.

Kör homogenisatorn på högsta hastighet under tvättsteget. Torka av sonden med en pappersnäsduk och låt sonden torka helt innan du homogeniserar nästa prov. Gör en visuell inspektion av sondens blad för att se om det finns rester av vävnadsbitar, och om sådana finns, rengör sonden igen.

Efter homogenisering, för in provvolymen till en milliliter med 100 procent etanol, och centrifugera sedan på högsta hastighet i 15 minuter. Sug försiktigt ut etanolen och lufttorka pelletsen i cirka 15 till 20 minuter innan du påbörjar proteinase K-extraktionen. Resuspendera pelletsen i 150 mikroliter proteinas K digestionsbuffert och vifta med rören för att lossa pelletsen.

Proteinas K digestion över natten rekommenderas för högre DNA-återvinning. Tillsätt 10 mikroliter av temperaturstabilt proteinas K och blanda genom att flacka. Inkubera vid 56 grader Celsius i 15 minuter med lätt omrörning.

Inkubera rören på is i tre minuter. Efter avkylning centrifugera röret i 15 minuter vid högsta hastighet. Överför sedan försiktigt varje supernatant till ett nytt mikrocentrifugeringsrör för RNA-rening utan att störa pelletsen.

Extrahera RNA och DNA med hjälp av det optimerade förfarandet i det skriftliga protokollet, vilket inkluderar en förlängd tid för uppslutning av vävnaden för DNA-extraktion. RNA och DNA kan återvinnas från äldre formalinfixerade paraffininbäddade vävnadsprover med denna metod. Nukleinsyror samextraherades från prostatacancerprover som var mellan tre och 14 år gamla.

Det genomsnittliga utbytet var 2 270 nanogram RNA och 820 nanogram DNA. Intressant nog fanns det ingen signifikant korrelation mellan vävnadsprovets ålder och nukleinsyrautvinning. Överlag var RNA- och DNA-avkastningen korrelerad mellan proverna, även om det i de flesta fall återfanns mer än dubbelt så mycket RNA i förhållande till DNA.

För att visa prestandan hos genomiskt DNA som extraherats med detta protokoll amplifierades bisulfitkonverterade DNA-extrakt från arkiverade prostatacancerprover med metyleringsspecifik PCR. ALU-repetitiva element användes som metyleringskontroll och visade liten variation mellan proverna. GSTP1, en gen som är känd för att vara hypermetylerad i prostatacancer, uppvisade ingen påvisbar amplifiering genom metyleringsspecifik PCR när DNA som extraherats från godartade prover användes.

DNA-prover från patienter med aggressiv prostatacancer uppvisade påvisbara QPCR-cykeltröskelvärden som var lägre än de från indolenta prostatacancerceller, vilket tyder på ökad metylering av GSTP1 i aggressiv prostatacancer. När man väl behärskar denna teknik kan den utföras på tre till fyra timmar för RNA, och efter en nattlig digestion på fyra timmar för DNA om den utförs på rätt sätt. Denna teknik bör göra det möjligt för forskare inom molekylär patologi att utforska diagnostiska DNA- och RNA-biomarkörer i en mängd olika cancerformer.

När du har tittat på den här videon bör du ha en god förståelse för hur man förbereder vävnadskärnor för extraktion av DNA och RNA från exakt kartlagda områden av intresse i arkiverade vävnadsblock.