Dr Bang var mycket intresserad av ryggradslösa djurs cirkulationssystem. Han trodde att studier av djur där cirkulationen kunde observeras skulle leda till en större förståelse för de fysiologiska processerna hos ryggradsdjur, till exempel människor.

I början av 1950-talet, när han arbetade vid Marine Biological Laboratory vid Wood’s Hole i Maine, studerade Bang hästskoskrabbans cirkulationssystem och dess reaktion på bakterieinfektion.

Han injicerade bakterier som han hade fått från färskt havsvatten i hästskoskrabbor av olika storlekar och studerade deras reaktion. Vanligtvis bildade blodet en liten koagel för att försegla det infekterade området och hindra fler bakterier från att ta sig in.

Men en dag märkte Bang att en av hans krabbor dog av en okänd infektion som hade orsakat att nästan hela blodvolymen i krabban hade koagulerat till en halvfast massa.

Det här hade aldrig setts förut!

Då isolerade och odlade han bakterien från det första djuret och injicerade den i andra hästskoskrabbor. De fick också samma koagulering och dog.

I samband med ytterligare undersökningar fann han att endast “gramnegativa” bakterier gav upphov till denna reaktion.

Note: In 1884, Hans Christian Gram invented a staining procedure for microscopy which came to be called The Gram stain. It stains the bacteria either red (Gram-negative) or violet (Gram-positive) depending on the chemicals they have in their cell walls.

Gramnegativa bakterier orsakar infektioner som lunginflammation och hjärnhinneinflammation. När Bang värmedödade bakterierna före injektionen fick han fortfarande samma koagulationsreaktion. Detta innebar att det inte krävdes levande bakterier för att få hästskoskrabbans blod att koagulera.

Han publicerade sina upptäckter 1956 och lade sina första observationer åt sidan i nästan tio år.

Det är Jack Levin som kommer in.

Ingenjör Jack Levin är en av de första som har en uppgift att lösa problemet med blodproppar. 1963, när Bang diskuterade data från sitt hästskoskrabbprojekt, föreslog en kollega att ett samarbete med en hematolog kunde hjälpa till att lösa mysteriet om blodproppar. Kollegan rekommenderade en forskare från hans labb, dr Jack Levin.

Levin använde kaniner för att studera Shwartzman-reaktionen – reaktionen på endotoxiner som gör att en propp bildas i ett blodkärl och som också förändrar ryggradsdjurens trombocytfunktion.

Endotoxin är en nyckelkomponent i cellväggen hos alla gramnegativa bakterier; det kan vara svårt att upptäcka och är resistent mot läkemedel.

Bang övertalade Levin att tillbringa en sommar vid Marine Biological Laboratory i Woods Hole där han studerade likheterna mellan Limulus amöbocyter och mänskliga blodplättar.

Han visade snabbt att cellfri plasma från en hästskogskrabba inte skulle koagulera, men när han studerade blodkropparna hade han problem med att hindra blodet från att koagulera.

Han hade också ett annat problem. Prover som var bra när han lämnade labbet på kvällen var koagulerade när han återvände på morgonen, och inget av de antikoagulantia som fanns på marknaden gjorde någon skillnad.

Serendipity Leads to an Aha! Moment

Levin var förbryllad och han började bli ganska desperat för att få reda på detta!

Kanske det berodde på bakterier eller någon komponent av bakterier?

För att testa denna möjlighet förberedde han nya prover i sterila, endotoxinfria glasvaror. Otroligt nog koagulerade inte blodet!

Det var då han insåg att han hade identifierat en blodkoaguleringsmekanism som utlöstes av närvaron av gramnegativa bakteriers endotoxin.

Tidigare kunde han visa att hela blodkoaguleringsmekanismen i Limulus ingick i amebocyterna och att den var ytterst känslig för närvaron av endotoxiner.

Limulus polyphemus amebocyter

“Jag tror att bara en forskare som arbetade med endotoxin någonsin skulle ha övervägt möjligheten att endotoxin orsakade blodkoagulation hos Limulus”, säger Levin.

Detta ledde till att Levin skapade och patenterade det extremt känsliga Limulus Amebocyte Lysate (LAL)-testet, som kunde testa bakteriella endotoxiner med hjälp av hästskoskrabbsblod.

Det enda andra testet för endotoxiner på den tiden kallades Rabbit Pyrogen Test. På den tiden krävde den amerikanska livsmedels- och läkemedelsmyndigheten att alla injicerbara läkemedel måste klara pyrogtestet innan de kunde godkännas för användning.

Pyrogtestet med kanin var dock en kostsam, ineffektiv och ofta felaktig process.

Du injicerar provet i en grupp kaniner. Om kaninerna fick feber i dessa kaniner misslyckades läkemedlet med testet. Om de inte fick feber inom 4-6 timmar klarade läkemedlet testet.

Läkemedelsföretag var tvungna att inhysa tusentals kaniner för att kunna utföra dessa tester.

LAL-testet kan ge ett resultat på så lite som 45 minuter och kan detektera förekomsten av endotoxiner vid nivåer på mindre än en del per triljon.

Levin insåg att han hade ett mycket känsligt och snabbt test! Detta var hård konkurrens för kanintestet.

LAL-testet kan ge ett resultat på så lite som 45 minuter och kan påvisa förekomst av endotoxiner på nivåer på mindre än en del per biljon.

Trots att LAL-testet först beskrevs 1965 tog det nästan 20 år innan testet formellt godkändes som endotoxintest för slutprodukter av FDA!

Varför tog det så lång tid?

Vi måste inse att människor inte tycker om att ändra på saker och ting och att företag verkligen motsätter sig förändringar. Att anta det nya, känsligare testet innebar att läkemedelsföretagen skulle behöva omarbeta och sätta upp en helt ny produktionslinje.

Det är tid och pengar!

Men grädden stiger så småningom till toppen; det här testet var gräddans grädde och är fortfarande gräddans grädde!

Förfrågan på LAL är nu så hög att det har blivit en av de mest värdefulla vätskorna på jorden, med ett rapporterat pris i april 2018 på mellan 35 000 och 60 000 dollar per gallon!

Skalering av LAL-testet

LAL-testet har utsetts till ett av de “100 viktigaste bidragen till folkhälsan” av Johns Hopkins Bloomberg School of Public Health.

Enligt Jack Levin är det det standardiserade screeningtestet för endotoxinförorening över hela världen, med cirka 17,5 miljoner testade prover (vilket motsvarar ungefär 70 miljoner utförda tester) varje år. Det används kommersiellt för att testa alla intravenösa vätskor, parenterala läkemedel och implanterbara medicintekniska produkter innan de används på patienter.

Hur tillverkas LAL?

Horseshoe crabs fångas och ett rör sticks in i dem för att suga upp deras blod (se bilden ovan). Sedan centrifugeras det insamlade blodet för att koncentrera amebocyterna. Genom att tillsätta vatten till de packade amebocyterna bryts de sönder och frigör koagulationsproteiner (lysat) som reagerar med endotoxinerna.

Detta sätt att framställa LAL framhålls som en icke-dödlig metod för att få blod från krabban. Men det är det inte. För alla krabbor överlever inte!

Enligt Atlantic State Marine Fisheries Commission, i sin 2019 Horseshoe Crab Stock Benchmark Stock Assessment and Peer Review Report, fångas och avblodas 600 000 hästskokrabbar för att tillgodose den årliga LAL-behovet.

Omkring 420-540 000 (70-90 %) av dessa 600 000 krabbor överlever förfarandet. Om man kombinerar detta med intrång i livsmiljön, global uppvärmning och ytterligare 500 000+ som skördas och dödas varje år för att användas som bete för ål- och valfiske, kan man förstå varför populationerna av hästskogskrabbar rasar.

Inte bara det, krabbarna skördas i maj och juni när de kommer i massor i land för att para sig, lägga sina ägg och förhoppningsvis upprätthålla sin överlevnad.

Detta är inte en hållbar situation!

Är det bättre sätt att göra LAL?

“Den amerikanska hästskoskrabban överlevde dinosaurierna och har överlevt fyra tidigare massutrotningar, men hotas nu av läkemedelsindustrin, fiskesamhällen, förlust av livsmiljöer, klimatförändringar och, senast, kvävande tidvatten av rödalger utanför USA:s östkust.” från Jonathan Watts i The Guardian

Det finns två primära insatser som lyfts fram som sätt att mildra denna olyckliga situation.

En metod som försöks av läkemedelsindustrin är akvakultur av hästskoskrabbor.

Inledningsvis var försöken att odla hästskoskrabbor inte särskilt framgångsrika. Det verkade som att efter 3-4 månaders odling sjönk hemolymfens proteinkoncentrationer till nivåer som leder till dödlighet. Man trodde att dessa dödsfall var kopplade till näringsbrist.

Dr. Anthony Dellinger är professor vid institutionen för neurovetenskap vid University of North Carolina i Greensboro och forskare vid Kepley Biosystems Incorporated, Greensboro, NC.

Dellinger och KBI har arbetat hårt med att utveckla ett nytt, förbättrat vattenbrukssystem. Deras utgångspunkt är att “kontrollerad insamling av LAL från övervakade och välskötta hästskoskrabbor i vattenbruk skulle kunna öka LAL-försörjningen, säkerställa artens livskraft och möjliggöra nya kliniska innovationer”.

Om det lyckas skulle en tillförlitlig, hållbar och ekonomisk produktion av större volymer av LAL vara till nytta för både natur och industri.

Dellinger och kollegor beskrev i detalj hur deras vattenbrukssystem fungerar i en artikel som publicerades i Frontiers of Marine Science i april förra året.

Låt oss titta på höjdpunkterna och resultaten av den studien.

För det första optimerade de ett recirkulerande vattenbrukssystem för inomhusbruk som på ett tillförlitligt sätt upprätthåller hästskoskrabborna. Deras mål var att underlätta repetitiv LAL-skörd samtidigt som djurens välbefinnande bibehålls.

Nästa milstolpe var att uppnå en metod för repetitiv skörd med låg inverkan. För att göra detta implanterade de kirurgiskt en kateter i hästskoskrabban. Alla deras tester visade att hästskoskrabborna tolererade dessa katetrar ganska bra.

Här är en snabb sammanfattning av deras resultat.

De skördade och skötte 24 krabbor i ett år med 100 % överlevnad. Hästskoskrabborna kontrollerades med avseende på LAL-aktivitet, ägg- och spermieavgivning och andra tecken som kan tyda på försämrad hälsa. Inga sådana tecken observerades.

Kräftorna blödde från katetrarna cirka tre gånger per månad, vilket potentiellt motsvarar cirka 36 blödningar per krabba under 12-månadersperioden. Inga problem från de implanterade katetrarna uppstod under denna tidsperiod.

När de räknade ut de kostnader som uppstått, utanför den initiala utformningen av vattenbrukssystemet, kom underhållet av krabborna upp i cirka 0,76 dollar per pund, en mycket överkomlig summa!

Den viktigaste frågan som behövde besvaras var:

Hur är LAL från de egenhållna hästskoskrabborna jämfört med LAL från nyskördade krabbor?

Som framgår av figur 6 från deras artikel fanns det ingen signifikant skillnad i LAL endotoxin koaguleringsaktivitet mellan de vattenodlade och de vilda krabborna. Och det fanns inte heller någon verklig skillnad i aktiviteten från blödningar som togs vid dag 1, 16 och 23.

Dessa resultat fick dem att dra följande slutsats,

“…vattenbruket skulle kunna tillgodose industrins behov i flera år med motsvarande 5-10 % av ett års årliga fångst, vilket skulle lämna nästan 600 000 HSC:er i naturen varje år därefter. Faktum är att dessa resultat tyder på att ∼60 000 HSC från vattenbruk skulle kunna blödas 12-24 gånger per år på ett hållbart sätt och överstiga den nuvarande biomedicinska efterfrågan på LAL.”

Det andra tillvägagångssättet eliminerar behovet av krabbor helt och hållet.

Jeak Ling Ding, tillsammans med sin make och forskningspartner Bow Ho, i Singapore, hade ett mål – att helt och hållet eliminera behovet av hästskosnäckor.

Hon studerade Carcinoscorpius rotundicauda, en asiatisk art som var mycket mindre än atlantiska hästskoskrabbor, och de kunde inte avblodas särskilt mycket utan att dö.

Dings forskning om LAL ledde till upptäckten att en molekyl som kallas faktor C var ansvarig för dess koagulationsverkan. Ding isolerade genen för faktor C och använde ett virus för att föra in den i tarmceller från insekter. Detta gjorde i princip insekterna till små fabriker som producerade faktor C.

De modifierade insekterna tillverkade tillräckliga mängder faktor C, som sedan kunde säljas som rekombinant* faktor C (rFC) på marknaden som ett fungerande substitut till LAL.

* Note: The word recombinant is a term used in molecular genetics to indicate a gene that has been isolated (cloned) and inserted into another organism's DNA so that organism makes the protein that gene specifies. Using a virus is one of many ways to accomplish this.

Istället för att skörda eller akvakulturera hästskoskrabbor och avbloda dem kan de nu odla stora mängder insekter och isolera rFC.

Läkemedelsföretag som har använt rFC har bekräftat att det fungerar lika bra som LAL och att produktionskostnaderna är jämförbara.

“Vi var bara så entusiastiska som forskare, så glada över att det fungerar”, sa Ding. “Och vi trodde att den rekombinanta faktorn C skulle införas över hela världen och att hästskoskrabban skulle räddas.”

Tyvärr stötte rFC på samma hinder för spridning som LAL gjorde när det introducerades. Även om rFC har funnits på marknaden sedan 2003 har det gått långsamt att få genomslag. Men undan för undan håller den på att övervinna hindren för att godkännas av FDA. Ursprungligen tillverkade endast en tillverkare det – det Schweizbaserade kemikalieföretaget Lonza Group.

2013 blev Hyglos GmbH det andra företaget som tillverkade rFC. Kevin Williams, senior forskare på Hyglos, säger att han anser att införandet och godkännandet av rFC borde ha skett för länge sedan. Hyglos GmbH har fått godkännande för dess användning av flera europeiska tillsynsmyndigheter.

I dag tror experterna att rFC i slutändan kommer att bli den dominerande metoden för att upptäcka endotoxiner, vilket gör att hästskoskrabbor helt och hållet slipper den industriella produktionen.

Det är något som hästskoskrabbor kan leva med!

Note: In these times of COVID-19, I wouldn't be surprised to see the obstacles removed even faster. Taking and applying research knowledge to improve patient wellbeing is happening faster than ever before. And in cases like this, that's a really good thing!

Vilket för oss till den sista frågan som jag vill titta på:

Varför bryr vi oss egentligen om om hästskoskrabbor överlever?

Är de inte bara uråldriga kvarlevor som vårt moderna ekosystem lätt kan klara sig utan? Massor av andra arter har dött ut och planeten verkar vara ganska okej.

Det är en giltig fråga, så låt oss titta lite djupare på den.

Den spontana reaktionen är: “Självklart vill vi rädda dem!”. Vi har tillräckligt många varelser på den här planeten som redan är hotade eller som redan har dött ut. Vi har helt enkelt inte råd att förlora fler.

Som jag sa är det mer en magkänsla, inte ett svar som man kan hänga sin hatt på. För att få ett bättre svar måste vi titta på hur hästskoskrabbor passar in i helheten.

Låt oss börja med vad de äter och vad som äter dem.

Den vuxna hästskoskrabban äter små blötdjur som blåmusslor och surströmmingsmusslor och maskar.

Sedan 2017 är blåmusslor inte i någon allvarlig fara, enligt den här rapporten från The Safina Center vid Stony Brook University. Detsamma gäller för både annelider och surfmusslor.

Ungdjur livnär sig på små partiklar av både alger och animaliskt material. I takt med att djuret växer i storlek ökar också det byte det äter.

På det hela taget ser det ut som om hästskogskräftor inte har några skadliga effekter på sina bytesarter.

Okej, det är den ena sidan av myntet. Hur är det med den andra? Vad äter hästskoskrabbor?

Horseshoe crab eggs are a food source for many organisms.

These include shorebird, some fish – striped bass, striped killifish, silversides, flounder – as well as sea turtles, crabs, and whelks. De är en viktig födokälla för 11 arter av flyttande kustfåglar. En förlust av dessa ägg skulle ödelägga dessa fågelpopulationer.

Loggerhead havssköldpaddor och kustfåglar som t.ex. den röda knuten är beroende av hästskoskrabbor.

Tusentals av dessa sköldpaddor vandrar till Chesapeake- och Delawarebukten på sommaren för att äta krabborna. Man tror nu att loggerheads lider av bristen på hästskoskrabbor i Chesapeake.

I några få anekdoter rapporteras att hästskoskrabbor dyker upp i magen på alligatorer och hajar.

Hästskoskrabbsungar kan också vara en viktig föda i den kustnära födoväven. Under sommaren och hösten svärmar larver och tidiga livsstadier av hästskogskräftor i de grunda vattenområdena. De här bitarna äts utan tvekan upp av fiskar och kustfåglar också.

Och det verkar som om det finns många andra djur som tycker att de är ganska smakliga och som skulle ha svårt att hitta enkla substitut.

För en varelse som har funnits i 450 miljoner år är vår förståelse långt ifrån fullständig när det gäller den roll som Limulus polyphemus spelar i det kustnära ekosystemet.

Med det nuvarande kunskapsläget när det gäller ekologin hos hästskoskrabbor kan vi inte slutgiltigt dra några slutsatser om hur viktig deras roll är. Vad vi kan säga är att de definitivt upptar en nisch som förtjänar mer seriösa studier.

Även så kommer jag ner på sidan för behovet av att bevara dem! Det är min attityd att “hellre vara säker än ledsen”. Vi vet helt enkelt för lite för att låta en art som Limulus polyphemus glida oss ur händerna och försvinna om vi kan förhindra det.

Så, finns det något du kan göra?

Om du råkar bo i närheten av en plats där hästskoskrabbor kommer för att lägga ägg, är det lätt att sätta igång och hjälpa till. Det finns program för att vända krabbor och undersökningar av lekande krabbor som är beroende av frivilliga.

Och slutligen, kom ihåg hästskoskrabban när du går till doktorn. Allt som injiceras eller implanteras i våra kroppar testas fortfarande för kontaminering av gramnegativa bakterier med LAL som tillverkas av hästskoskrabbsblod.

Till nästa gång

Rich

Hej! Om du gillade den här artikeln kan du prenumerera på mitt nyhetsbrev och få en gratis e-bok!

Informationskällor som använts för den här artikeln:

1. Hästsko krabba
2. Hästsko krabba som en hållbar källa för endotoxintestning
3. Hästsko krabbors roll i den biomedicinska industrin och de senaste trenderna som påverkar artens hållbarhet
4. Hästsko krabbors sista dagar i den blåa-Blood Harvest
5. Hästskogskräftans undervattenshemligheter
6. Denna krabba kan rädda ditt liv – om människan inte utrotar den först
7. NJ avslutade sin skörd av hästskogskräftor. Bör andra stater göra detsamma?
8. Hästskokrabben – en webbplats skapad av Kayla Westerlund
9. Atlantiska hästskokrabben