ImmunohistokemiRedigera
Immunohistokemi eller IHC-färgning av vävnadssektioner (eller immunocytokemi, som är färgning av celler) är kanske den mest använda tekniken för immunfärgning. I de första fallen av IHC-färgning användes fluorescerande färgämnen (se immunofluorescens), men andra icke-fluorescerande metoder som använder enzymer som peroxidas (se immunoperoxidasfärgning) och alkaliskt fosfatas används nu. Dessa enzymer kan katalysera reaktioner som ger en färgad produkt som är lätt att upptäcka med ljusmikroskopi. Alternativt kan radioaktiva element användas som märkning, och immunreaktionen kan visualiseras genom autoradiografi.
Vävnadspreparation eller fixering är nödvändig för att bevara cellmorfologi och vävnadsarkitektur. Olämplig eller långvarig fixering kan avsevärt minska antikroppsbindningsförmågan. Många antigener kan framgångsrikt påvisas i formalinfixerade paraffininbäddade vävnadssektioner. Vissa antigener överlever dock inte ens måttliga mängder aldehydfixering. Under dessa förhållanden bör vävnaderna snabbt frysas friskt i flytande kväve och skäras med en kryostat. Nackdelarna med frysta sektioner är bland annat dålig morfologi, dålig upplösning vid högre förstoringar, svårigheter att skära över paraffinsektioner och behovet av fryst förvaring. Alternativt kräver vibratomsektioner inte att vävnaden behandlas med organiska lösningsmedel eller hög värme, vilket kan förstöra antigeniciteten, eller att vävnaden störs genom frysning och upptining. Nackdelen med vibratomsektioner är att sektioneringsprocessen är långsam och svår med mjuka och dåligt fixerade vävnader, och att chattermärken eller vibratomlinjer ofta är synliga i sektionerna.
Detektering av många antigener kan förbättras dramatiskt genom antigenhämtningsmetoder som verkar genom att bryta en del av de tvärbindningar mellan proteiner som bildats genom fixering för att avslöja dolda antigena platser. Detta kan åstadkommas genom uppvärmning under olika lång tid (heat induced epitope retrieval eller HIER) eller med hjälp av enzymbildning (proteolytic induced epitope retrieval eller PIER).
En av de största svårigheterna med IHC-färgning är att övervinna specifik eller ospecifik bakgrund. Optimering av fixeringsmetoder och fixeringstider, förbehandling med blockeringsmedel, inkubation av antikroppar med hög salthalt och optimering av tvättbuffertar och tvätttider efter tvätt av antikroppar är alla viktiga för att erhålla högkvalitativ immunfärgning. Dessutom är det viktigt att det finns positiva och negativa kontroller för färgning för att bestämma specificiteten.
FlödescytometriRedigera
En flödescytometer kan användas för direkt analys av celler som uttrycker ett eller flera specifika proteiner. Cellerna immunfärgas i lösning med metoder som liknar dem som används för immunofluorescens och analyseras sedan med flödescytometri.
Flödescytometri har flera fördelar jämfört med IHC, bl.a.: möjlighet att definiera distinkta cellpopulationer genom deras storlek och kornstorlek; förmåga att sortera ut döda celler; förbättrad känslighet; och flerfärgsanalys för att mäta flera antigener samtidigt. Flödescytometri kan dock vara mindre effektiv när det gäller att upptäcka extremt sällsynta cellpopulationer, och de arkitektoniska relationerna går förlorade i avsaknad av ett vävnadssnitt. Flödescytometri har också en hög kapitalkostnad i samband med inköp av en flödescytometer.
Western blottingRedigera
Western blotting gör det möjligt att detektera specifika proteiner från extrakt gjorda från celler eller vävnader, före eller efter eventuella reningssteg. Proteiner separeras i allmänhet efter storlek med hjälp av gelelektrofores innan de överförs till ett syntetiskt membran via torra, halvtorra eller våta blottingmetoder. Membranet kan sedan undersökas med antikroppar med metoder som liknar immunohistokemi, men utan behov av fixering. Detektion sker vanligen med hjälp av peroxidaskopplade antikroppar som katalyserar en kemiluminiscent reaktion.
Western blotting är en rutinmässig molekylärbiologisk metod som kan användas för att semikvantitativt jämföra proteinnivåer mellan extrakt. Storleksseparationen före blotting gör det möjligt att mäta proteinets molekylvikt jämfört med kända molekylviktsmarkörer.
Enzyme-linked immunosorbent assayRedigera
Enzyme-linked immunosorbent assay eller ELISA är en diagnostisk metod för kvantitativ eller semikvantitativ bestämning av proteinkoncentrationer från blodplasma, serum eller cell-/vävnadsextrakt i ett plattformat med flera brunnar (vanligtvis 96 brunnar per platta). I stort sett adsorberas proteiner i lösning på ELISA-plattor. Antikroppar som är specifika för det aktuella proteinet används för att undersöka plattan. Bakgrunden minimeras genom att optimera blockerings- och tvättmetoderna (som för IHC), och specificiteten säkerställs genom förekomsten av positiva och negativa kontroller. Detektionsmetoderna är vanligtvis kolorimetriska eller kemiluminiscensbaserade.
ImmunelektronmikroskopiRedigera
Elektronmikroskopi eller EM kan användas för att studera den detaljerade mikroarkitekturen hos vävnader eller celler. Immun-EM gör det möjligt att detektera specifika proteiner i ultratunna vävnadssektioner. Antikroppar märkta med tungmetallpartiklar (t.ex. guld) kan visualiseras direkt med hjälp av transmissionselektronmikroskopi. Immuno-EM är kraftfullt när det gäller att upptäcka ett proteins subcellulära lokalisering, men det kan vara tekniskt utmanande, dyrt och kräver noggrann optimering av metoderna för fixering och bearbetning av vävnad. Biotinylering av proteiner in vivo föreslogs för att lindra de problem som orsakas av den frekventa inkompatibiliteten mellan antikroppsfärgning och fixeringsprotokoll som bättre bevarar cellmorfologin.