Diskussion

Den mänskliga mikrobiotan består av mer än tusen olika bakteriearter och spelar en viktig roll för människans hälsa genom att främja näringstillförsel, förhindra kolonisering av patogener och forma och bibehålla normal immunitet i slemhinnan. Inom denna stora grupp av bakterier har probiotiska kosttillskott som innehåller LAB (dvs. laktobaciller och bifidobakterier) påståtts ha en rad positiva effekter på människors hälsa, t.ex. förebyggande av diarré och inflammatoriska tarmsjukdomar eller profylax av urogenitala infektioner. Vår kunskap om de biokemiska roller som specifika arter och stammar spelar för människors hälsa och sjukdomar är dock mycket begränsad. I den här studien ville vi öka förståelsen för nitratreduktionsvägarna i utvalda vanliga bakteriearter som koloniserar människans tarm genom att använda in vitro-förhållanden som är kompatibla med nitratrika dieter och syrehalter som finns på slemhinneytorna i mag-tarmkanalen. De primära resultaten av vår undersökning visar att: 1) E. coli, en fakultativ anaerob bakterie, omvandlar nitrat till nitrit och därefter till ammoniak som successivt ackumuleras i odlingsmediet. 2) L. plantarum, en fermentativ bakterie, som odlas i närvaro av exogent hem och vitamin K2, utför liknande processer. 3) E. coli-enzymerna genererar betydande NO från nitrit endast under anaeroba förhållanden. 4) Alla LAB-odlingar som undersökts genererar stora mängder mjölksyra, vilket orsakar en tillräcklig försurning av odlingsmediet för att driva nitritdisproportionering till NO.

De flesta eukaryoter får sin energi främst genom oxidativ fosforylering och måste andas O2 för att bilda ATP, men många tarmbakterier, inklusive E.coli K12-stammar, kan använda NO3- som en alternativ elektronacceptor när O2 är begränsande och nitrat är rikligt förekommande. E.coli är en modellmedlem av Enterobacteriaceae och även om denna familj endast utgör en liten del av tarmmikrobiota är den särskilt viktig eftersom vissa stammar kan orsaka sjukdomar. Det har också nyligen visats att nitrat som genereras som en biprodukt av en inflammation hos värden kan användas av E.coli under andning för att ge en tillväxtfördel och konkurrera ut mikrober som bor i tjocktarmen och som enbart förlitar sig på jäsning . L. plantarum anses vara en säker probiotisk bakterie och finns vanligen i däggdjurens tarmkanaler och i människans saliv, där man vet att nitrater ackumuleras till millimolära nivåer på grund av den entero-salivariska nitratcykeln, som står för cirka 25 % av det totala cirkulerande nitratet . Denna bakterie uppvisar den typiska fakultativa heterofermentativa vägen för LAB-familjen, men unikt för denna art identifierades nyligen gener som kodar för ett förmodat nitratreduktasystem (narGHJI) i L. plantarum WCFS1-genomet, vilket tyder på att den kan använda nitrat som elektronacceptor . En nyligen publicerad genetisk analys av L. plantarum har visat på dess enormt varierande och mångsidiga metaboliska förmåga.

I våra experiment påvisades en betydande nitratreduktasaktivitet både i E.coli och L. plantarum när syrgasspänningen minskar från atmosfärisk nivå mot noll. Tvärtom visade B.longum infantis, en mikro-lufttolerant anaerobe från spädbarnens mag-tarmkanal, ingen förmåga att reducera nitrat, inte ens vid höga koncentrationer. Bifidobakterier utgör upp till 90 % av bakterierna i ett spädbarns mag-tarmkanal, och våra resultat stämmer överens med observationen att bröstmjölk, som innehåller särskilt höga nitrithalter, utgör en kostkälla för nitrit innan de lingual- och tarmmikrobioter som har förmågan att reducera nitrat och som normalt återfinns i den vuxna floran har bildats.

I figur 1 visade vi att E.coli-kulturer som innehöll 5 mM NO3- hade en konkurrensmässig tillväxtfördel jämfört med kulturer utan tillsats av nitrat, och sedan bestämde vi effekten av syre- och nitratgradienter på produktionen av nitrit och ammoniak. Våra resultat visar att cirka 2,5 mM NO3- vid antingen 4 % eller lägre O2 är tillräckligt för att inducera uttrycket av nitratreduktasenzymer och att det efter 24 timmar ackumulerades en avsevärd mängd nitrit både i E.coli-cellerna och i odlingsmedierna. En detaljerad molekylär analys av regleringen av bakteriernas enzymaktiviteter överskrider räckvidden för denna studie, men det är väl känt att E.coli K12-stammar uttrycker tre molybdeninnehållande nitratreduktas och att volfram kan inaktivera dessa enzymer genom att ersätta molybdenatomen på den aktiva platsen. Vi fann att tillsatsen av 300 μM volframoxid till kulturer som odlats enligt de experiment som redovisas i figur 1 nästan helt avskaffade bildandet av nitrit (data visas inte). Vi tror alltså att molybdenberoende nitratreduktasar är ansvariga för det avgörande steget i nitritbildningen. Det är också viktigt att notera att E.coli, liksom många andra bakteriearter, är mottagliga för nitrittoxicitet på grund av bildandet av metall-nitrosylkomplex och att de minimerar denna toxicitet genom samordnad induktion av en nitritmembrantransportör och andra enzymer som förmedlar nitritreduktion. En fullständig beskrivning av E.coli nitrat- och nitritreduktasenzymernas gener och operons reglering och uttryck finns i utmärkta publikationer av Stewart och Cole .

Kväveoxidreduktionsvägar i människans tarm

Närvaron av nitrat och nitrit i den nedre delen av mag-tarmkanalen beror på ett flertal aspekter, bland annat på vilka typer av bakterier som koloniserar tarmen och på den intrikata balansen mellan kosten och kväveoxidernas metaboliska vägar. Den endogena produktionen av nitrat från NO-oxidation (huvudsakligen via reaktion med oxyhemoglobin) har dock länge erkänts vara en storleksordning större än intaget via kosten, vilket visades i slutet av 1970-talet och på senare tid i studier med eNOS-deficienta möss . I den schematiska framställningen i figur 5 har vi sammanfattat kopplingen mellan bakteriell respiratorisk denitrifikation, kväveoxidreduktion till ammoniak, den endogena L-arginin/NO-syntasvägen och den icke-enzymatiska nitritreduktionen till NO. I denitrifikationsprocessen (röd ruta) reduceras nitrat till kvävgas (N2) i en process i fyra steg där nitrit, NO och dikväveoxid är elektronacceptorer i energiproducerande reaktioner. Nyligen har det visat sig att en fullständig denitrifikationsväg, som leder till produktion av N2, finns i tandplack hos människor och även om den fortfarande anses vara av mindre betydelse för människor, spekulerar vi i att den kan ha en viktig roll vid mycket låg syretryckspänning i närvaro av nitrat, och bildandet av N2 kan inte uteslutas i människans tarm. Denitrifikation och dissimilatorisk nitratreduktion till ammoniak (DNRA, blå ruta) delar det första nitrat- till nitritreduktionssteget och flera klasser av nitratreduktas har förknippats med denna reaktion. I DNRA är det andra steget den direkta reduktionen av nitrit till ammoniak med sex elektroner, vilket inte ger energi men är en ganska vanlig avgiftningsprocess i fakultativt anaeroba bakterier. DNRA har föreslagits utgöra den viktigaste vägen för nitratmetabolismen i däggdjurens vommen. I denna studie identifierades ammoniak som en produkt av nitratreduktion i E.coli- och Lactobacilli-bakterier som odlas i närvaro av mM nitrat vid 4 % syre eller lägre nivåer.

Expand

Respiratorisk denitrifikation kan också generera små men relevanta mängder NO som mellanprodukt och har involverats i den bakteriella NO-produktionen i tarmen . Andra möjliga vägar som ger NO är den sura omvandlingen av nitrit (grön ruta) och oxidationen av L-arginin av NOS-enzymer (brun cirkel). I figur 4C undersökte vi protonberoendet av den icke-enzymatiska disproportioneringen av nitrit och visade att den blir relevant endast när det intracellulära pH-värdet eller pH-värdet i kroppsvätskan är lägre än 5,5. Våra resultat utesluter också förekomsten av aktiva NOS-enzymer i E.coli och L.plantarum, men tarmepitelceller är kända för att producera NO genom uttryck av både endoteliala och inducerbara NOS-isoformer. Intressant nog kan NO-produktionen i tarmen också utlösas av de enzymatiska processerna hos peroxidaserna, som förekommer rikligt på cellerna i tarmslemhinnan och som har visat sig använda nitrit som substrat för att producera NO som en del av sin antibakteriella verkan.

Vi tror att alla dessa olika nitratreduktionsvägar kan samexistera och uppträda samtidigt, men det är troligt att endast en metabolit skulle dominera beroende på de specifika fysiologiska förhållandena.

Fysiologisk betydelse av NO-bildning genom bakteriell nitratreduktion

Dietärt nitrat och nitrit framställs fortfarande som möjliga giftiga ämnen i många studier trots de ökande bevisen för att NO-produktion från dessa joner har viktiga fördelaktiga implikationer för kardiovaskulära, immunförsvars- och gastrointestinala funktioner . I tarmen fyller NO flera fysiologiska funktioner, t.ex. reglering av slemhinnans blodflöde, tarmens rörlighet och slemhinnans tjocklek. Kronisk överproduktion av NO har också förknippats med inflammatoriska tarmsjukdomar och kan sannolikt hämma tillväxten av en mängd olika bakteriearter. Tidigare studier lämnade oklart hur tarmbakterier producerade NO, men Sobko et al. visade att i motsats till konventionella råttor är NO-nivåerna i tarmen hos bakteriefria råttor extremt låga och när de inokulerades med normal bakterieflora ökade den observerade NO-produktionen 10 gånger.

I våra experiment bestämde syre- och protonkoncentrationer den specifika vägen för nitratreduktion till NO. De resultat som presenteras i figur 4A tyder på att E.coli är kapabel till enzymatisk NO-aktivitet under anaeroba förhållanden med nitratkoncentrationer större än 1 mM möjligen via denitrifikation eller det periplasmatiska cytokrom c nitritreduktasenzymet (Nrf) enligt Corker och Pooles förslag . Denna NO-generering minskar dock kraftigt vid 2 % syre och blir nitratoberoende. Det är viktigt att våra uppgifter stämmer överens med Sobko och kollegors rapport om att E. coli genererade obetydliga NO-nivåer under 24 timmars inkubation med 0,1 mM nitrat . LAB producerade betydande mängder NO som svar på försurning av medierna på grund av ackumulering av mjölksyra. Ersättning av tillväxtmediet med färsk LMRS (pH = 6,5) blockerade nästan helt LAB-kulturernas förmåga att omvandla nitrit till NO, men inte hos E.coli. Mätningar av tarmens pH ligger mellan 5,7 och 7,5, vilket innebär att nitritdisproportionering in vivo troligen är en mindre och lokaliserad aspekt av NO-produktionen. Omvänt är denna väg ett väletablerat fenomen i magsäckens sura miljö (pH ca 3).

Sammanfattningsvis föreslår vi att det NO som genereras av tarmbakterier i närheten av tarmslemhinnan antingen kan utöva de gynnsamma effekter som nämnts ovan eller, vid högre nivåer, störa dessa funktioner. Således kan bakteriell NO-bildning i tarmen betraktas som en regulator av både fysiologiska och patologiska effekter.

Fysiologiska implikationer av bakteriell ammoniakbildning för hälsan

Colonebakterier har varit kända för att producera ammoniak från aminosyradeamineringen eller via ureas, hydrolys av urea till koldioxid och ammoniak, sedan de banbrytande studierna av Vince et al. i början av 1970-talet . Nyligen rapporterade Cole och medarbetare att den viktigaste produkten av nitritreduktion i E.coli är ammoniak och att endast 1 % reduceras till NO vid neutralt pH . Resultaten från vår studie tyder på att åtminstone vissa vanliga tarmbakterier i första hand reducerar nitrit till ammoniak snarare än NO. Hos friska personer, under vanliga fysiologiska förhållanden, utsöndras huvuddelen av den ammoniak som bildas i den nedre delen av mag-tarmkanalen i kroppsvätskorna och metaboliseras av leverns hepatocyter, där ammoniak och koldioxid enzymatiskt omvandlas till karbamoylfosfat, som går in i den serie reaktioner som kallas “ureacirkeln” och som leder till att det bildas urea som sedan elimineras av njurarna (se fig. 5). Den normala plasmakoncentrationen av ammoniak ligger i intervallet 10-35 μM, men när ammoniakproduktionen är överdriven kan ammoniak i portalblodet gå förbi levern, vilket leder till hyperammonemi . Ammoniak i blodet tränger fritt genom blod-hjärnbarriären och höga halter (>100 μM) har toxiska effekter på det centrala nervsystemet som leder till encefalopati och slutligen koma. Patienter med levercirros utvecklar mycket ofta hepatisk encefalopati (HE). I avsaknad av leversvikt har hyperammonemisk koma tillskrivits sepsis orsakad av mikroorganismer med ureasförmåga, t.ex. Klebsiella pneumonia . Klassiska terapeutiska metoder för HE innebär en minskning av de systemiska ammoniaknivåerna genom antibiotikabehandling (för att döda ammoniakproducerande bakterier i tarmen) och administrering av icke-absorberbara sockerarter, t.ex. laktulos och lactitol . I tjocktarmen bryts laktulosan ner av tarmbakterier, främst till mjölksyra och även till små mängder myrsyra och ättiksyra . Denna försurning gynnar bildandet av den icke-absorberbara ammoniumjonen från ammoniak och minskar dess koncentration i plasma. Det är oklart i vilken utsträckning kostnitrat bidrar till ammoniakkoncentrationen i tarmen och blodet, men vi föreslår den alternativa hypotesen att den ökade försurningen av koloninnehållet på grund av förekomsten av laktulosa gynnar mikrobiotens omvandling av nitrit till NO i stället för ammoniak genom den kända syraberoende mekanismen.

Slutsatser

I över 30 år har man inte kunnat redogöra för det biologiska ödet för exogent nitrat i de utsöndrade kväveinnehållande föreningarna som uppgår till cirka 60 % av en intagen nitratdos hos människor. Våra resultat stöder idén att nitrat omvandlas till nitrit och sedan till andra reducerade kvävebiomolekyler som NO, ammoniak, urea och eventuellt kvävegas av bakterier i saliv, mage, tunn- och tjocktarm. Frågor som hur mycket ammoniak som genereras från nitrat-nitritreduktionen jämfört med andra viktiga processer, t.ex. deaminering och bakteriell ureasaktivitet, kräver detaljerade metaboliska studier på djur och/eller människor. Den biologiska betydelsen av omvandlingen av nitrater från kosten i tarmlumen återstår att fastställa. Traditionell japansk kost och medelhavsdiet, som är kända för sina kardiovaskulära skyddande effekter, har dock ett genomsnittligt intag av nitrat per person som är två till tre gånger högre än den typiska västerländska kosten (i Förenta staterna motsvarar det cirka 40-100 mg/dag nitrat). Det behövs ytterligare undersökningar om kopplingen mellan symbiotiska bakterier, kväveoxidmetabolism och människors hälsa, men det står klart att de biologiska vägarna för kvävemetabolism hos däggdjur är mer komplexa och viktiga än vad man kunde föreställa sig för bara några år sedan.