Cellcykeln längs majsens primära rot

Majsens primära rot delades in i på varandra följande segment som angav gränserna för rotkapseln, den apikala meristemförlängningszonen och differentieringszonen, i enlighet med tidigare resultat (Alarcón et al., 2016). Avståndet från RCJ till rotspetsen uppskattades till 457 µm, vilket togs bort innan roten delades in i flera zoner. Rotens apikala meristematiska zon (MZ) ligger i den mest apikala 1,5 mm av roten från RCJ och övergångszonen (TZ) fortsatte till 3 mm. Den snabba förlängningszonen (EZ), där cellerna förlängs snabbt, tilldelades 3-6 mm; och i områden långt från 6 mm observerade vi att cellförlängningshastigheten börjar minska, vilket indikerar att tillväxten är avslutad (Verbelen et al., 2006). Zoner som ligger 12-20 mm och 20-30 mm från RCJ är differentieringszoner (DF), där laterala rötter inleder sin utveckling. Liknande dissektioner av rötter gjordes i Arabidopsis, där roten dissekerades i fem sektioner som är kortare än de i majsroten (Cools et al., 2010). Nyligen har ett differentiellt genuttryck längs Arabidopsis rot rapporterats, och de reprimerade eller inducerade generna varierar främst i förändringen från den meristematiska zonen till övergångszonen samt från övergångszonen till förlängningszonen (Chaiwanon och Wang, 2015).

Rotmeristemets gräns bestäms av cellcykelns utgång och balansen mellan celldelning och cellförlängning (Perilli et al., 2012). Flödescytometriprofilen visar cellcykelutvecklingen längs primärroten, och data som visar antalet relativa celler i cellcykelfaserna indikerar cellaktiviteten i flera rotzoner. När cellerna lämnar cellcykeln kan de därför sluta cykla. Dessutom antas det allmänt att cellens utträde ur cellcykeln sker efter mitos och att beslutet att gå in i en ny cellcykel fattas vid övergångspunkten G1-till-S som svar på tillväxtfaktorer och olika hormoner (Gutierrez et al., 2002; Inzé och De Veylder, 2006; Polyn et al, 2015).

I fig. 1 visar vi att i rötter på 150-160 mm som odlats vid 30 °C är meristemet praktiskt taget begränsat till MZ, zonen 0-1,5 mm från RCJ där andelen celler i G0/G1-, S- och G2/M-faserna var cirka 27, 23 respektive 39 (tabell 1). Den relativa varaktigheten för G1, S, G2 och M i Allium meristem har uppskattats till 26,5, 44,5, 16,5 respektive 12,5 % (Giménez-Martín et al., 1977), och dessa procentsatser är mycket likartade i andra arter. Även om våra resultat rapporterade att majsmeristem har en lägre andel celler i S-fas var värdena (23 %) tillräckliga för att indikera cellcykelprogression (Reichheld et al., 1999). Dessa relativa proportioner förändrades extraordinärt när TZ analyserades, i denna zon. Procentandelarna var 9, 10 och 68 %, för G0/G1-, S- respektive G2/M-fasen. Detta resultat tyder på att cellerna började lämna cellcykeln när de nådde 1,5 mm från RCJ. Procentandelen i EZ tyder dessutom på att cellerna har lämnat cellcykeln vid 3 mm (fig. 1, tabell 1). Dessutom kompenserades minskningen av andelen celler i G0-G1- och S-faserna med en ökning i G2-M (tabell 1, fig. 2). Dessa resultat visar tydligt att cellerna stoppar cellcykeln när de befinner sig i fas G2.

Det har rapporterats att de flesta celltyperna lämnar meristemet i G1-fas, och på senare tid utlöses G1-till-S-övergången endast i perikelceller för att initiera lateralrot (Vanneste et al., 2007). I Arabidopsis pericykel har det föreslagits att celler som gränsar till protoxilempolerna fortsätter cellcykeln utan avbrott när de passerar genom övergångs-, förlängnings- och differentieringszoner (Dubrovsky et al., 2008). Dessa celler är de enda som delar sig för att initiera laterala rotprimordier. Resten av de celler som utgör roten delar sig dock inte. Sedan fortsätter inte epidermal- och cortexcellerna som utgör majoriteten av rotvävnaderna att cykla när de lämnar rotmeristemet.

I vår analys observerade vi en anmärkningsvärd ökning av celler i fas G2 i TZ och EZ. Detta resultat tyder på att celler som lämnar meristem i fas G2 inte genomgår mitos, utan de stannar vid denna G2-fas och stannar kvar i den. Vi spekulerar i att celler som lämnar meristem i G1- eller S-fas fortsätter cellcykeln till G2, där de slutar. Detta grundar sig på observationen att minskningen av andelen celler i G0/G1 mellan MZ och TZ (29,7 %) kompenseras av en ökning i G2 (28,8 %) (tabell 1, fig. 2). En svag minskning av procentandelen G2 uppnås mellan EZ och den basala änden av DZ (20-30 mm från RCJ). Denna lilla minskning, tillsammans med minskningen av hyperploida kärnor, kompenseras av ökade hypoploida nivåer (tabell 1).

Å andra sidan har det rapporterats att TZ i majsens apexrot inte är engagerade i mitotiska delningar, och i denna zon är postmitotiska kärnor placerade i en central position i cellen (Baluška et al., 2001). Dessutom har inga mitotiska figurer observerats längs rotzonen; initiering av laterala rotprimordier observerades mellan 20-25 mm från RCJ (Alarcón et al., 2016). I Arabidopsis är det genomsnittliga avståndet till den tidigaste mitosen i pericykeln 3194 µm och den första mitosen har observerats vid 2205 µm från rotspetsen (Dubrovsky et al., 2001). I majsroten, endast 20-30 mm från RCJ, visade vissa pericykel motsatta xylemceller kondensat cytoplasma, vilket indikerar att de återinträder i cellcykeln (Alarcón et al., 2016). Dessa skillnader kan orsakas av den högre förlängningshastigheten för rötter i majs som växer 80-90 mm/dag, medan Arabidopsis endast förlängs 10 mm/dag (Dubrovsky et al., 2001).

Det har visats med hjälp av en vävnadsspecifik kvantitativ mikroskopisk analys att vissa celler i cortex och epidermis befann sig i den första endocykeln (DNA-innehåll mellan 4C och 8C) vid starten av deras förlängning. Dessutom genomförde kärnorna i metaxylemelementen i övergångszonen en eller två endocyklar som nådde 32C när de började förlängas snabbt (Baluška, 1987, 1990; Baluška och Kubica, 1984; Baluška et al., 1995). Nyligen har endoreduplikation beskrivits ske i växter innan cellerna påbörjar differentiering (De Veylder et al., 2007). Vi observerade dock inte ett relevant antal kärnor med ploidynivå högre än 4n. Om endoreduplikation var en vanlig process i majsens rotspets skulle vi dessutom förvänta oss att hyperploidin skulle öka när vi analyserade zoner längre bort från RCJ. Hyperploidin ökade dock inte bara inte i zonerna förlängningszoner, utan minskade (tabell 1).

Det har rapporterats att pericykelceller förblir i G1-fas tills de återinträder i cellcykeln (Vanneste et al., 2007). Pericykelcellerna utgör dock bara en liten del av den totala mängden celler som bildar rotspetsarna; epidermal- och cortexceller är de vanligaste celltyperna i rotspetsen. Om cirka 70 % av de totala cellerna lämnar meristemet i G2-fasen måste de flesta epidermal- och cortexcellerna befinna sig i G2-fasen när de lämnar meristemet. Man antar att epidermal- och cortexcellens förlängning kontrollerar rotarnas längdtillväxt (Alarcón et al., 2014b). Därför bör celler som är involverade i den differentieringsprocess som resulterar i rotförlängning vara i G2-fas.