RESULTAT OCH DISKUSSION
En A375-melanomcellinje med en konstitutivt aktiverad MAPK på grund av en BRAFV600E-mutation behandlades med MEK-hämmaren U0126 i en koncentration på 25 μM i 8 timmar, vilket resulterade i att ERK-fosforyleringen undertrycktes (fig. 1 a). Immunsuppressiva lösliga faktorers mRNA, inklusive IL-6, IL-10 och VEGF, minskade signifikant med U0126-behandlingen (fig. 1 b), medan kontrollbehandlingen med DMSO inte påverkade produktionen av IL-10- och VEGF-mRNA och endast ökade IL-6-mRNA-nivån något. En 18-timmars exponering för U0126 undertryckte också produktionen av IL-10, VEGF och IL-6 på proteinnivå, vilket tyder på att aktiverade ERKs kan vara ansvariga för att undertrycka lokala immunsvar mot melanom genom att producera dessa immunosuppressiva faktorer (fig. 1 c). Dessutom inträffade undertryckandet av ERK-fosforylering och inhiberingen av IL-6-, IL-10- och VEGF-produktion även efter att koncentrationen av U0126-behandlingen minskats till 10 μM (ej avbildat). Under denna studie observerades inga signifikanta cytotoxiska effekter med U0126-behandlingen av A375-cellerna. Även om U0126 är känt för att hämma MEK5 utöver MEK1/2, upptäcktes inte fosforylerat ERK5, MEK5-substratet, i A375-cellerna (ej avbildat), vilket tyder på att MEK1/2-ERK1/2-vägen är ansvarig för de effekter som observerats med U0126-behandling. De undertryckande effekterna av U0126 på IL-10- och VEGF-produktion påvisades också i tre andra melanomcellinjer med BRAFV600E-mutationen, 624mel, 888mel och 928mel, utan någon signifikant celltoxicitet (fig. 1 d). Eftersom dessa melanomcellinjer inte producerar IL-6 verkar aktiverad MAPK-signalering ha en allmän roll i produktionen av de immunosuppressiva faktorerna IL-10 och VEGF i BRAFV600E+ melanomcellinjer.
Minskad produktion av immunosuppressiva lösliga faktorer IL-6, IL-10 och VEGF från melanomcellinjer med konstitutivt aktiv MAPK genom BRAFV600E-mutationen genom hämning av MAPK-signalering med en MEK-hämmare, U0126. (a) Hämning av fosforylering av ERK1/2 detekterades genom Western blot-analys av melanomcellinjen A375mel med BRAFV600E-mutationen före och 2, 4, 6 och 8 timmar efter behandling med MEK-hämmaren U0126 i en koncentration på 25 μM. (b) Hämning av mRNA-uttryck för immunosuppressiva lösliga faktorer IL-6, IL-10 och VEGF i A375-celler. MRNA för olika lösliga faktorer, inklusive IL-6, IL-10 och VEGF, mättes med kvantitativ RT-PCR före och 2, 4, 6 och 8 timmar efter behandling med U0126. Kontrollbehandlingen utfördes med en DMSO-lösning. MRNA-nivåerna vid varje tidpunkt normaliserades till GAPDH mRNA och angavs som det relativa värdet i förhållande till 0 h. (c) Minskad produktion av IL-6-, IL-10- och VEGF-proteiner från A375-celler efter 18 timmars behandling med U0126 vid en koncentration på 25 μM. Uttrycket detekterades med ELISA med odlingssupernatanten. Förhållandet mellan livsdugligheten hos U0126-behandlade celler och DMSO-behandlade celler vid skörden var 77 %. Cytokinproduktionen normaliserades till värdet för kontroll DMSO-behandlade celler baserat på cellantalet. Western blot visade stark hämning av ERK-fosforylering, men inte av STAT3-proteinet eller dess fosforylering vid Ser727 och Tyr705. (d) Minskad produktion av IL-10 och VEGF från tre melanomcellinjer med BRAFV600E-mutationen, 624mel, 888mel och 928mel efter 18 timmars behandling med U0126 i en koncentration på 25 μM, vilket detekterades genom ELISA med odlingssupernatanten. Förhållandet mellan livsdugligheten hos U0126-behandlade celler och DMSO-behandlade celler vid skörden var 95 % för 624mel, 103 % för 888mel och 100 % för 928mel. Cytokinproduktionen normaliserades till värdet för kontroll DMSO-behandlade celler baserat på cellantalet. Western blot visade stark hämning av ERK-fosforylering, men inte av STAT3-protein. En liten minskning av Ser727-fosforylering av STAT3 observerades i 888mel- och 928mel-celler, men inte i 624mel-celler. Dessa resultat är representativa för tre eller fyra oberoende experiment med liknande resultat.
Också icke-specifika effekter av U0126 på cytokinproduktionen via andra vägar än MAPK-signalering kan dock inte helt uteslutas från dessa experiment på grund av den observerade svaga minskningen av STAT3-fosforylering vid Ser727 i 888mel och 928mel (fig. 1 d). För att bekräfta rollen för den aktiverade MAPK på grund av BRAFV600E-mutationen i produktionen av IL-10, VEGF och IL-6 transfekterades BRAFV600E-specifik RNAi i tre melanomcellinjer, A375, 888mel och 624mel, med hjälp av lentivirus som uttrycker BRAFV600E-specifikt kort hårnåls-RNA (shRNA) (11). Den BRAFV600E-specifika RNAi hämmade signifikant produktionen av IL-10, VEGF och IL-6 samt undertryckte ERK-fosforylering (fig. 2). Dessa resultat bekräftar att inhiberingen av dessa faktorer av U0126 (fig. 1) korrelerar med den specifika inhiberingen av MAPK-vägen. Dessa resultat överensstämmer med nyligen publicerade artiklar som visar ERK1/2-inducerad IL-10-produktion i murina makrofager (12) och BRAFV600E-beroende VEGF-produktion för främjande av angiogenes (13).
Minskad produktion av de immunosuppressiva faktorerna IL-6, IL-10 och VEGF från tre melanomcellinjer med BRAFV600E-mutationen med hjälp av BRAFV600E-specifik RNAi. De tre melanomcellinjerna med BRAFV600E-mutationen, A375mel, 888mel och 624mel, infekterades med lentivirusvektorer som kodade för kort hårnåls-RNA för antingen firefly luciferase mRNA (GL3B; som kontroll) eller BRAFV600E mRNA (BRAF#1′) vid 50 eller 100 infektionsmultiplikationer. 5 eller 6 dagar efter infektionen extraherades proteiner och utsattes för Western blot-analys. En kraftig minskning av fosforylering av ERK1/2 med minskning av BRAF-proteinet observerades av BRAFV600E-specifik RNAi. Ingen signifikant skillnad i STAT3-protein och fosforylering av STAT3 vid Ser727 eller Tyr705 observerades. En liten minskning av fosforylering vid Ser727 observerades i 888mel- och 624mel-celler efter BRAF RNAi. 5 eller 6 d efter lentivirusinfektionen fördelades lika många melanomceller med en densitet på 1-2 × 106 celler/2 ml, och odlingssupernatanterna efter 18 timmar utsattes för ELISA för IL-6, IL-10 eller VEGF. En kraftig minskning av IL-6, IL-10 och VEGF observerades. Ett representativt resultat av två eller tre oberoende experiment med liknande resultat visas.
Eftersom aktiverad STAT3-signalering har konstaterats resultera i immunförsvarets undvikande av cancer genom produktion av olika faktorer, inklusive VEGF (8, 9), undersökte vi förhållandet mellan MAPK- och STAT3-vägarna när det gäller produktionen av immunosuppressiva faktorer i melanomcellinjen A375. Produktionen av IL-6, IL-10 och VEGF hämmades kraftigt av RNAi som riktade sig mot antingen enbart BRAFV600E eller enbart STAT3 (fig. 3 a). Ingen tydlig additiv eller synergistisk effekt observerades genom samtidig begränsning av BRAF-MAPK- och STAT3-vägarna (fig. 3 a). BRAFV600E RNAi i A375-cellerna minskade inte STAT3:s DNA-bindningsaktivitet (fig. 3 b), STAT3-promotoraktiviteten (fig. 3 c) eller STAT3-fosforylering vid vare sig Ser727 eller Tyr705 (fig. 2), även om ERK:er rapporterades ha potentiell förmåga att fosforyla STAT3 vid Ser727 (14). STAT3-fosforylering kan dock också ske genom en ERK-oberoende väg (15). I 624mel-cellerna, även om det fanns en liten minskning av Ser727-fosforylerat STAT3, påverkades inte DNA-bindningsaktiviteten (fig. 3 b) och STAT3-promotoraktiviteten (fig. 3 c) av BRAFV600E RNAi (fig. 2). I 888mel-celler fanns en liknande minskning av Ser727-fosforylering, men omvänt minskade både STAT3 DNA-bindningsaktivitet (fig. 3 b) och STAT3-promotoraktivitet (fig. 3 c) efter BRAFV600E RNAi (fig. 2). Dessa resultat tyder på att minskningen av STAT3:s transkriptionsaktivitet inte är den huvudsakliga mekanism som genererar den immunosuppressiva faktorsuppressionen genom nedreglering av MAPK-signalering i dessa melanomcellinjer.
Hämning av IL-6-, IL-10- och VEGF-produktion i A375-celler genom RNAi för enbart BRAFV600E, enbart STAT3 eller båda, utan att det skedde någon signifikant förändring av STAT3:s DNA-bindnings- och promotoraktivitet. (a) Djup hämning av IL-6, IL-10 och VEGF-produktion i A375-celler genom RNAi för enbart BRAFV600E, enbart STAT3 eller båda. 5 eller 6 d efter infektionen dispenserades lika många av cellerna med en densitet på 106 celler/2 ml, och odlingssupernatanten efter 18 timmar utsattes för ELISA för IL-6, VEGF och IL-10. Minskning av BRAF och fosforylerat ERK1/2 genom BRAFV600E-specifik RNAi och minskning av STAT3 genom STAT3-specifik RNAi bekräftades genom Western blot-analys. Ett representativt resultat av sex oberoende experiment med liknande resultat visas. (b) Ingen signifikant förändring av STAT3:s DNA-bindningsaktivitet genom hämning av MAPK-signalering med BRAF RNAi i melanomcellinjer. STAT3 DNA-bindningsaktivitet undersöktes genom EMSA av kärnextrakt från melanomcellinjer med antingen kontroll GL3B eller BRAF#1′ shRNA-vektorbehandling. Specifika STAT3-band som anges med pilar försvann med kall vildtyp STAT3 DNA-sond (wt), men inte med mutant STAT3 DNA-sond (mt). Endast en liten minskning av STAT3 DNA-bindningsaktiviteten observerades i 888mel-celler. (c) STAT3-reporteranalyser i A375-, 624mel- och 888mel-celler. 2-4 × 105 celler med antingen kontroll- eller BRAF#1′ shRNA-vektorinfektion transfekterades med 0,4 μg pSTAT3-TA-Luc och 0,4 μg pRL-SV40 med Effectene Transfection Reagent. 24 timmar efter transfektionen skördades cellerna och analyserades för firefly- och renilla luciferasaktivitet. Varje firefly luciferasaktivitet normaliserades med renilla luciferasaktiviteten. Skuggade staplar och felstaplar anger medelvärde och standardavvikelse för tredubbla analyser, respektive. Ett representativt experiment av tre eller fyra oberoende experiment visas. STAT3-driven transkription förändrades inte efter BRAF RNAi i A375 och 624mel, men den minskade något i 888mel.
Nästan undersöktes de potentiella effekterna orsakade av de lösliga faktorer som induceras av MAPK- och STAT3-signalering i supernatanten från A375-kulturerna vid mognad av DCs. Supernatanten från de odlade A375-melanomcellerna innehåller lösliga faktorer som hämmar mognaden av humana monocytderiverade DC (MoDC) när de stimuleras med Toll-like-receptor-ligander såsom LPS. Tillsatsen av A375-kulturens supernatant till MoDC-kulturer i en slutkoncentration på 10-20 % minskade signifikant produktionen av inflammatoriska cytokiner, inklusive IL-12 och TNF-α, i MoDC:er samt CD1a- och CD83-molekyler på cellytan, men inte CD80, CD86, CD40 eller HLA-DR på MoDC:er. Supernatanter från de andra tre melanomcelllinjerna gav samma resultat när de tillsattes till MoDC-kulturerna (ej avbildat). Den suppressiva aktiviteten hos melanomcellsupernatanterna härrör från produktionen av IL-6, IL-10 och VEGF eftersom tillsatsen av specifika antikroppar för dessa faktorer minskade den suppressiva aktiviteten hos A375-kulturens supernatanter (fig. 4 a). Skillnader mellan våra observationer och de tidigare rapporterade resultaten om murin B16 melanomcells supernatant med en aktiverad STAT3 som hämmar uttrycket av MHC klass II och CD40 kan förklaras av olika tumörceller eller arter (8).
Minskad suppressiv aktivitet hos A375 melanomkultursupernatanter genom förbehandling med RNAi för enbart BRAFV600E, enbart STAT3 eller båda på LPS-inducerad IL-12 och TNF-α produktion från DCs. (a) Neutralisering av IL-6, IL-10 eller VEGF i kultursupernatanten från A375 melanomceller återställde inhiberingen av IL-12 produktion från LPS-stimulerade humana DCs. Humana MoDCs odlades med A375-supernatanten i närvaro eller frånvaro av den monoklonala antikroppen för IL-6, IL-10, VEGF eller en isotypkontrollantikropp på 1 μg/ml. IL-12-produktionen i odlingssupernatanterna bestämdes med ELISA 24 timmar efter LPS-stimulering med 100 ng/ml. (b) CD14+ monocyter isolerades från PBMC:er med hjälp av MACS och odlades i medier som innehöll RPMI 1640, 10 % (vol/vol) FBS, 100 ng/ml GM-CSF och 50 ng/ml IL-4 med eller utan 20 % (vol/vol) av odlingssupernatanten från A375mel-cellerna som framställts i fig. 3. (a) Hälften av medierna, cytokinerna och odlingssupernatanten byttes ut varannan dag. På dag 5 av odlingen tillsattes LPS med 100 ng/ml. Efter 15 h samlades odlingssupernatanterna upp och utsattes för ELISA av IL-12 och TNF-α.
Den suppressiva aktiviteten hos A375-kulturens supernatanter på IL-12- och TNF-α-produktionen hos de LPS-behandlade MoDC:erna återställdes genom att förbehandla A375-cellerna med antingen RNAi som riktade sig mot enbart BRAFV600E, enbart STAT3, eller både BRAFV600E och STAT3 (fig. 4 b). Även om STAT3-RNAi verkade minska den suppressiva aktiviteten hos A375-kulturens supernatanter mer än BRAFV600E-RNAi kan skillnaden helt enkelt bero på olika RNAi-aktiviteter. Det är dock viktigt att notera att det inte observerades några additiva och synergistiska effekter av RNAi med samtidig inriktning på BRAF och STAT3, vilket återigen tyder på att båda signalvägarna har en viktig roll i produktionen av suppressiva faktorer för DC-mognad. Även om aktivering av DCs av supernatanten från den murina CT26-cellinjen för tjocktarmscancer som transfekterats med en dominant-negativ form av STAT3 möjligen genom ökad produktion av proinflammatoriska cytokiner hade rapporterats, observerades ingen aktivering av DCs i den här studien. Det kan förklaras av en ofullständig hämning av BRAF och STAT3, ingen ökad produktion av proinflammatoriska cytokiner i de BRAF shRNA-transfekterade melanomcellerna, eller av skillnader i tumörceller eller arter.
Sammanfattningsvis har vi för första gången påvisat en väsentlig roll för MAPK-signalering tillsammans med STAT3-vägen på produktionen av olika immunosuppressiva faktorer i melanomcellinjer med konstitutivt aktiv MAPK på grund av den gemensamma BRAFV600E-mutationen. Således kan MAPK-vägen vara ett potentiellt betydelsefullt molekylärt mål för att övervinna immunförsvaret vid olika cancerformer eftersom den ofta aktiveras i flera typer av cancerformer, inklusive melanom utan BRAFV600E-mutation (16, 17).