Abstract

Med framstegen inom nanobioteknologin har miljövänliga tillvägagångssätt för växtmedierad biosyntes av silvernanomaterial (AgNP) blivit mer attraktiva för biomedicinska tillämpningar. Denna studie är en rapport om biosyntes av AgNPs med hjälp av Chlorophytum borivilianum L. (Safed musli) callusextrakt som en ny källa till reduktionsmedel. AgNO3-lösning som utmanats med det metanoliska callusextraktet uppvisade en färgförändring från gult till brunt på grund av bioreduktionsreaktionen. Vidare karakteriserades AgNPs med hjälp av UV-visible spektrofotometri, röntgendiffraktion (XRD), Atomic Force Microscopy (AFM) och Fourier Transform Infrared Spectroscopy (FTIR). UV-vis-spektrumet avslöjade AgNPs ytplasmonresonansegenskaper vid cirka 450 nm. XRD-mönstret med typiska toppar visar att silvret är av kubiskt ansiktecentrerad natur. AFM-analysen bekräftade förekomsten av sfäriskt formade och väldispergerade AgNPs med en genomsnittlig storlek på 52,0 nm. Vidare bekräftade FTIR-analysen att olika fytokonstituenter i callusextraktet är inblandade i bioreduktionsprocessen för att bilda nanopartiklar. AgNPs var effektivare när det gäller att hämma de testade patogena mikroberna, nämligen Pseudomonas aeruginosa, Bacillus subtilis, meticillinresistenta Escherichia coli, Staphylococcus aureus och Candida albicans jämfört med callus-extraktet. 3(4,5-dimetylthiazol-2-yl)-2,5-difenyltetrazoliumbromid (MTT) bekräftade den cytotoxiska egenskapen hos AgNPs mot cellinjen för humant kolonadenokarcinom (HT-29) på ett dosberoende sätt. Vid högre koncentrationer av 500 μg/mL AgNPs observerades cellviabiliteten vara endast 7 % efter 24 timmar med ett IC50-värde på 254 μg/mL. Därför visar dessa AgNPs tydligt att de har en stor potential att användas i olika biomedicinska tillämpningar inom en nära framtid.

1. Introduktion

Som ett framväxande vetenskapsområde i den moderna världen har nanotekniken varit till stor nytta för människan. Nanoteknik syftar till att producera och utnyttja material i nanostorlek som mäter mellan 1 och 100 nm . De unika egenskaperna hos material i nanostorlek gör dem mer attraktiva för användning inom olika områden, särskilt för leverans av läkemedelsmolekyler, bildanalys, som biomarkör, biodetektion av makromolekyler eller patogener etc. . Flera olika typer av metaller används för syntes av nanomaterial för specifika biomedicinska tillämpningar. De omfattar silver (Ag), guld (Au), titandioxid (TiO2), zinkoxid (ZnO), kopparoxid (CuO), magnesiumoxid (MgO), kalciumoxid (CaO) och kiseldioxid (Si). Dessa nanostrukturer uppvisar unika fysikalisk-kemiska och biologiska egenskaper, inklusive styrka, plasticitet, hållbarhet och funktioner. De används därför i stor utsträckning på olika områden, bland annat inom elektronik, biomedicin och bioteknik. Eftersom silver har antimikrobiell aktivitet har det under de senaste åren använts i stor utsträckning vid framställning av olika antimikrobiella medel. I dag används silver för att syntetisera silvernanopartiklar (AgNP) för olika tillämpningar inom medicin, livsmedel, hälsovård osv. Detta beror på att AgNPs med ett större förhållande mellan yta och volym har unika biologiska, elektriska, termiska och optiska egenskaper .

Det finns flera metoder för att syntetisera AgNPs, bland annat kemiska, fysikaliska och biologiska metoder . Den föredragna metoden är dock att använda den biologiska vägen som involverar växtföreningar eller växtextrakt, mikrober eller deras produkter. Detta beror främst på säkerhet, kostnadseffektivitet och miljövänliga aspekter. Kemiska och fysikaliska metoder innebär däremot giftiga kemikalier, mycket energi, stort tryck och hög temperatur . AgNPs framställdes successivt med hjälp av olika växtextrakt, t.ex. Leptadenia reticulata , Cassia didymobotrya , Andrographis paniculata , Prunus japonica , Talinum triangulare , Euphorbia antiquorum , Thymbra spicata och Cleome viscosa . Nyligen syntetiserades AgNPs från växtkallus som en ny källa. Till exempel används callus från Catharanthus roseus, Sesuvium portulacastrum, Taxus yunnanensis, Centella asiatica, Cucurbita maxima etc. för biosyntes av AgNPs . Det är fördelaktigt att callusodlingar mildrar problemen med bristen på vilda växtkällor. Dessutom är callusextrakt effektivare när det gäller att producera mer distinkta och spridda AgNPs jämfört med dem som biosyntetiseras med hjälp av blattextrakt med högre bioaktivitet.

Chlorophytum borivilianum L. (Safed musli) är en uppskattad medicinalväxt som har rikligt med bioaktiva komponenter, t.ex. fenoler, saponiner, flavonoider, alkaloider, tanniner, steroider, triterpenoider och vitaminer. Växten är effektiv för att bota kronisk blödning, diabetes, artrit, högt blodtryck och fördröjd menopaus. För att lösa problemen med odling av Safed musli på fältet har man använt sig av vävnadskulturer för att få fram dess bioaktiva föreningar. Charl et al. har tidigare visat att callusodling av Safed musli är en tillförlitlig källa för sekundära metaboliter i växter. Vidare har de också rapporterat den antimikrobiella och antioxidativa aktiviteten hos Safed musli callus-extrakt. Hittills finns det dock ingen rapport om biosyntesen av AgNP med hjälp av Safed musli-växten eller dess callus. I denna studie redovisas därför en biologisk metod för att syntetisera AgNPs med hjälp av Safed musli callus-extrakt för att utvärdera deras biologiska egenskaper.

2. Material och metoder

2.1. Beredning av kallusextrakt av Safed musli

För att initiera kallusodlingar av Safed musli följdes den metod som förklaras av Nakasha et al. I korthet inokulerades skottknoppar av Safed musli på fast Murashige och Skoog-medium som innehöll 5 mg/L 2,4-diklorfenoxiättiksyra och odlades i 4 veckor och skördades sedan. För att förbereda callusextraktet maldes 20 g callus i färskvikt tillsammans med 100 ml metanol och kokades i cirka 5 minuter. Extraktet filtrerades med hjälp av Whatman nr 1-filterpapper och förvarades vid 4 °C. Extraktet användes för framställning av AgNP inom en vecka.

2.2. Biosyntes av AgNPs

Omkring 10 mL callusextrakt utmanades med 90 mL 1 mM AgNO3 (silvernitrat)-lösning som fanns i en Erlenmeyerkolv (250 mL). Reaktionsblandningen hölls i rumstemperatur på en skakapparat (150 rpm) utan ljus. Färgförändringen registrerades med jämna mellanrum upp till 5 timmar, och AgNPs förvarades i rumstemperatur i 3 månader för att kontrollera stabiliteten. Reaktionsblandningen centrifugerades vid 20 000 rpm i 15 minuter för att koncentrera de biogent syntetiserade AgNPs för ytterligare karakterisering.

2.3. Karaktärisering av AgNPs

2.3.1. UV-visibel spektralanalys

Förändringen av färgbildningen i reaktionsblandningen övervakades visuellt. Ungefär 2 mL av lösningen samlades regelbundet upp efter 1, 3 och 5 timmars inkubation, och reduktionen av silverjoner mättes vid 300-600 nm UV-siktligt spektrum med hjälp av en spektrofotometer (ELICO, Indien).

2.3.2. Analys av röntgendiffraktion (XRD)

På glasobjektsglaset tillsattes en enda droppe AgNP-lösning och belades. Den analyserades senare för att registrera de biosyntetiserade nanopartiklarnas kristallina natur med hjälp av en röntgendiffraktometer (XRD), modell XRD-6000, Shimadzu, Japan, med 40 kV och 30 mA med Cu ka-strålning vid 2θ angel.

2.3.3.3. Atomic Force Microscopy (AFM)

Med hjälp av AFM (A.P.E. Research A100, Italien) karakteriserades AgNPs för att observera deras morfologiska egenskaper. Först sonicerades lösningen som innehöll AgNPs vid rumstemperatur i 15 minuter med hjälp av en ultraljudsmaskin. Senare torkades AgNP-lösningen för att bilda ett tunt skikt på ett glimmerbaserat glasobjektsglas, och detta användes för observation under AFM.

2.3.4. Analys av Fourier Transform Infraröd Spektroskopi (FTIR)

FTIR-analys av biogent syntetiserade AgNP:er utfördes med hjälp av ett Perkin Elmer FTIR-spektrum-användande KBr-pellets med hjälp av ett Shimazdu IR Prestige-21 FTIR-instrument med diffust reflekterande läge (DRS-8000). Alla mätningar utfördes i intervallet 400-4000 cm-1.

2.4. Utvärdering av antibakteriell aktivitet

De biosyntetiserade AgNPs bedömdes för sin antimikrobiella aktivitet med hjälp av en skivdiffusionsmetod mot vanliga humanpatogena grampositiva bakteriestammar, Bacillus subtilis B29 (ATCC 29737), meticillinresistenta Staphylococcus aureus (MRSA) (ATCC700698) (Gram-positiv), Pseudomonas aeruginosa (ATCC 15442) och Escherichia coli E266 (Gram-negativ) och en svampart, Candida albicans 90028. Alla mikrobiella stammar har erhållits från Laboratory of Molecular Biomedicine, Institute of Bioscience, UPM, Serdang, Malaysia. Alla bakteriestammar odlades på Mueller-Hinton Agar (MHA), medan C. albicans 90028 odlades på potato dextrose agar (PDA). För att utvärdera den antibakteriella aktiviteten användes diskdiffusionsmetoden med små ändringar. I korthet svabbades renodlingen av varje mikrob jämnt ut på de separata petriplattorna med hjälp av sterila bomullstops. Kulturmediet placerades med sterila skivor (6 mm i diameter) belagda med olika koncentrationer (100, 200 och 300 μg/mL) av AgNPs och det metanoliska bladextraktet. Dimetylsulfoxid (DMSO) (10 μg/μL) och gentamycin (10 μg/skiva) användes som negativ respektive positiv kontroll mot alla testade mikrober. Varje behandling upprepades fem gånger och försöket upprepades två gånger. Alla plattor inkuberades vid 37 °C i 24 timmar och uppkomsten av hämmande zoner (mm) registrerades med hjälp av en linjal.

2,5. Utvärdering av cytotoxicitet mot koloncancercellinjen HT-29

Vi utvärderade den cytotoxiska effekten av mykogena AgNPs på koloncancercellinjen HT-29 som tidigare rapporterats . I korthet odlades cellerna på Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM) som innehöll penicillin (100 U/mL), streptomycin (100 g/mL), L-glutamin (2 mM) och fetalt bovint serum (10 %). Ungefär 5 × 104 celler användes för inokulering i en brunn i 96-hålsplattor. En CO2-inkubator justerad till 37 °C användes för att inkubera cellerna i 48 timmar. För att studera cytotoxiciteten behandlades cellerna med biosyntetiserade AgNPs (10, 20, 40, 80, 120 och 160 μg/mL) och inkuberades i 48 timmar för att utvärdera cellernas överlevnadsförmåga med hjälp av 3-(4,5-dimetylthiazol-2-yl)-2,5-difenyltetrazoliumbromid (MTT)-testet. Först förbereddes färsk MTT-lösning (5 mg/ml) och cirka 10 ml av den fördelades i varje brunn. Den förvarades sedan för inkubation i upp till 4 timmar under samma förhållanden. Med hjälp av en multiwell ELISA-plattläsare dokumenterades absorbansen vid 570 nm. Den erhållna absorbansen omvandlades till procentuell cellviabilitet med hjälp av följande formel:

2,6. Statistisk analys

Alla experiment replikerades tre gånger och upprepades tre gånger. De data som erhölls från varje experiment representerades som avvikelse (SD).

3. Resultat och diskussion

3.1. Callusbildning och syntes av AgNPs

Syntes av AgNPs genom den biologiska vägen har fått större betydelse på senare tid på grund av att den biologiska metoden ger stabila och enhetliga AgNPs med överlägsen farmakologisk betydelse . I denna studie användes Safed musli callus-extrakt som substrat för att syntetisera AgNPs vid rumstemperatur. I denna studie skördades gulfärgade spröda calli som bildades efter 2 månader (figur 1).

Figur 1

Visar callusbildningen på MS-medium kompletterat med 2,4-D (5 mg/L) efter 2 månader.

Tydligen anses Safed musli calli i detta skede vara mogna och välutvecklade för att utsöndra sekundära växtmetaboliter. Därför användes kalli som skördades efter två månader i processen för att syntetisera AgNPs . Generellt sett varierar produktionen och egenskaperna hos nanopartiklarna beroende på vilka bioaktiva föreningar som förekommer i lösningsmedelsextrakt från en växtart . När AgNO3-lösningen utmanades med det metanoliska callusextraktet från Safed musli ändrades färgen från gul till ljusbrun på grund av bioreduktionsreaktionen (figur 2). Detta tyder tydligt på biosyntesen av AgNPs, som är korrelerad med exciteringen av ytplasmonresonansvibrationer i AgNPs . Färgförändringen observerades omedelbart inom en timme, och färgens intensitet ökade med inkubationstiden upp till 5 timmar. Mer än 5 timmars inkubation visade dock ingen observerbar förändring av färgen. Färgintensiteten ökade gradvis med ökad inkubationstid och förblev högst efter 5 timmars inkubation. Hittills är de exakta mekanismer som är inblandade i biosyntesen av AgNPs från växtextrakt inte klart förstådda. Några möjliga mekanismer som kan vara inblandade i biosyntesen har dock föreslagits. Följaktligen kan de cellulära enzymerna tillsammans med förekomsten av olika klasser av fytokomponenter, t.ex. fenoler, flavonoider, fytosteroler, terpenoider, organiska syror, alkaloider och alkoholer, som förekommer i växtextrakt effektivt minska bildandet av AgNPs från silverjoner . Tidigare har forskare rapporterat att inkubationstiden för att fullborda biologisk reduktion av silverjoner för att bilda AgNPs varierar från en växtart till en annan på grund av skillnader i förekomsten av fytokomponenter i växtextrakten .

Figur 2

Gul färg på Safed musli callus-extraktet (A), genomskinlig färg på AgNO3-lösningen (B) och brun färg på reaktionsblandningen efter 48 timmars exponering för AgNO3, vilket indikerar bildandet av AgNPs (C).

3.2. Karaktärisering av AgNPs

3.2.1. Analys av UV-visibelt spektroskopi

Användningen av UV-visibelt spektroskopi, XRD, AFM och FTIR-analys har gett information relaterad till storlek, form, dispersion och yta av callusextraktmedierade AgNPs. UV-spektrumet visade förekomsten av en skarp absorbanstopp vid cirka 450 nm, vilket tyder på förekomsten av AgNPs (figur 3). Enligt tidigare rapporter indikerar det UV-visionella absorptionsbandet mellan 425 och 460 nm ytplasmonresonans (SPR) hos AgNPs . Denna SPR-topp tillsammans med de bioreducerande ämnena i callusextraktet kan möjligen vara inblandade i täckningen för att bilda och stabilisera AgNPs . Förekomsten av en bred topp kan korreleras med AgNPs polydispersa natur med sfärisk form.

3.2.2. XRD-analys

Observation av diffraktionstoppar i XRD-analysen ger detaljer om den kristallina naturen och den kemiska sammansättningen av de biosyntetiserade AgNPs. Resultatet av XRD-mönstret för AgNPs som syntetiserats med hjälp av Safed musli callus-extrakt illustreras i figur 4. De diffrakterade intensiteterna från 20° till 70° registrerades. De observerade topparna vid 2θ på 38,34°, 44,54° och 64,6° motsvarar (111), (200) respektive (220) plan i silverets kubiska struktur. Dessa resultat är likartade med resultatet från Joint Committee on Powder Diffraction Standards (JCPDS nr 04-0783). Andra mindre toppar som observerats kan också korreleras med de kristallina organiska föreningar som adsorberas på AgNP-ytan. Liknande diffraktionsmönster observerades också av tidigare resultat relaterade till AgNPs syntetiserade från växtkällor .

Figur 4

XRD-mönster av biosyntetiserade AgNPs med hjälp av callus-extrakt av Safed musli.

3.2.3. AFM-analys

AFM-analys utfördes för att registrera de topologiska egenskaperna hos biosyntetiserade AgNPs från callusextrakt av Safed musli. Resultatet avslöjade tydligt att förekomsten av sfäriskt formade AgNPs är jämnt utspridda (figur 5). Storleken på AgNPs varierade mellan 35,1 och 168,0 nm med en genomsnittlig storlek på 52,0 nm. De biosyntetiserade AgNPs hade en ojämnhet på 7,9 nm och en ojämnhet på 14,6 nm (figurerna 5 a och 5 b). Dessa observationer bekräftar de tidigare rapporterade nanoregimerna och sfäriskt formade AgNPs som biosyntetiserats från olika växtarter, inklusive Leptadenia reticulata, Murraya koenigii, Centella asiatica, Cleome viscosa och Coptidis rhizoma .

(a)

(b)

(a)
(b)

3.2.4. FTIR-analys

Den troliga interaktionen mellan biosyntetiserade AgNPs och olika växtföreningar som förekommer i Safed musli callusextrakt bestämdes genom FTIR-analys. Dessa fytokomponenter ackrediteras för att fungera som reducerande och stabiliserande medel under deras AgNP biosyntes . Figur 6 visar FTIR-spektraldata för biosyntetiserade AgNP med 14 tydliga toppar i området 4000-500 cm-1 . En bred topp vid 3437,86 cm-1 motsvarar sträckningsvibrationerna hos -O-H- och -N-H-grupperna. Likaså är toppen vid 2920,59 cm-1 resultatet av -C-H-grupper. Banden vid 1623,72 cm-1 och 1376 cm-1 kan bero på C=C-gruppernas sträckningsvibrationer och förekomsten av C-N-liknande amin- eller C-O-liknande fenolgrupper. Vågnumret 1382,41 kan hänföras till -CH2-gruppen. Toppen vid 1019,38 beror på C=O-gruppernas sträckning. Tre svaga band vid 828,4, 671,13 och 615,95 cm-1 motsvarar böjningsvibrationer hos -O-H- och C-H-grupper. Liknande observationer har gjorts av tidigare forskare på andra växtbaserade AgNPs . Dessutom kan dessa absorbanstoppar vara kopplade till många fytokemiska föreningar som finns i kallusextraktet från Safed musli. Till stöd för detta har en tidigare studie av Charl et al. bekräftat förekomsten av olika fytokonstituenter med hjälp av gaskromatografi-masspektrometrianalys. Sammantaget visar FTIR-data att Safed musli callus-extraktet är multifunktionellt i processen för bioreduktion och för att stabilisera AgNPs.

Figur 6

FTIR-spektraldata för AgNPs som producerats av callusextrakt från Safed musli.

3.3. Bedömning av antibakteriell aktivitet

AgNPs uppvisar ett brett spektrum av antimikrobiell aktivitet och används därför ofta i kliniska tillämpningar . Deras användning som antimikrobiella medel kommer dock att vara effektiv och kan endast tillämpas efter det att problemen med de negativa biverkningarna har lösts . Därför utvärderade vi antimikrobiell aktivitet hos de biosyntetiserade AgNPs från Safed musli callus-extrakt mot humana patogener. Det observerades att AgNPs effektivt hämmade alla testade bakteriestammar på dosberoende sätt (tabell 1). Intressant nog uppvisade AgNPs en högre hämmande zon jämfört med callusextraktet. Den högsta hämmningen av AgNPs observerades mot C. albicans ( mm) följt av B. subtilis ( mm) och E. coli ( mm) vid 300 μg/mL koncentration. Alla mikrober hämmades dock av AgNPs vid koncentrationen 300 μg/mL. Den maximala hämmande aktiviteten observerades mot B. subtilis () följt av C. albicans () och E. coli () vid 300 mg/mL koncentration av AgNPs. Tidigare har forskare föreslagit några möjliga mekanismer för antimikrobiell verkan av växtbaserade AgNPs. AgNPs denaturerar mikrobernas cellvägg, destabiliserar det yttre membranet, blockerar den cellulära andningen, hämmar biosyntesen och stör protonmotivationskraften. Den antimikrobiella aktiviteten beror också på att AgNPs har ett större förhållande mellan yta och volym. Resultaten av den aktuella studien visar tydligt att AgNPs syntetiserade från Safed musli callus-extrakt skulle kunna användas som antibakteriella medel för att behandla många mänskliga sjukdomar.

3.4. AgNPs mot cancerceller

Det gjordes dessutom en bedömning av AgNPs aktivitet mot cancercelllinjen HT-29 med hjälp av MTT-analysen. Resultaten av studien representeras i figur 7. Den procentuella andelen cellviabilitet minskade med ökade koncentrationer av AgNPs från 0 till 500 μg/mL. Det tyder tydligt på att AgNPs uppvisar dosberoende cellhämmande aktiviteter. Vidare minskade den procentuella andelen cellviabilitet när exponeringstiden ökade från 24 timmar till 48 timmar. Efter 24 timmar uppmätte kontrollbehandlingarna 100 % cellviabilitet, medan endast 7 % av cellerna överlevde vid 500 μg/mL AgNPs, vilket ytterligare minskade till 2 % efter 72 timmars inkubationstid. Detta tyder på en hög toxicitetseffekt av AgNPs. Även om biosyntetiserade AgNPs uppvisar mindre toxicitet vid lägre doser, ger de en mycket hög dödlig effekt vid högre doser. På samma sätt har tidigare forskare dokumenterat den potentiella cellhämmande effekten av växtbaserade AgNPs på ett dosberoende sätt . IC50-värdet för AgNPs beräknades till 254, 216 och 174 μg/mL efter 24 timmars, 48 timmars respektive 72 timmars behandling.

Figur 7

Cytotoxicitetsresultat av biosyntetiserade AgNPs med hjälp av callusextrakt från Safed musli.

I en tidigare rapport anges att Safed musli callus extrakt har olika klasser av fytokemikalier . Fytokomponenternas reaktiva funktionella grupper, såsom hydroxyl-, karboxyl- och aminogrupper, kopplas alltså samman med silverjoner för att uppvisa en högre cytotoxicitet. Det är också bevisat att silverjoner tillsammans med reaktiva funktionella grupper interagerar kraftigt med den cellulära arkitekturen för att orsaka cellskador.

Det är dessutom bevisat att silverjoner har en stark affinitet till sulfhydrylgrupper i essentiella enzymer och fosforinnehållande baser. Därför interagerar AgNPs effektivt med nukleinsyror och orsakar DNA-skador genom att störa mitokondriernas andningskedja, uppmuntra bildandet av reaktiva syrearter, hämma DNA-replikation och celldelning, främja apoptos osv. Dessutom bidrar andra egenskaper hos AgNPs, t.ex. nanoregimens natur, sfärisk form och partikelytan, också till cancerbekämpande egenskaper. På samma sätt har det rapporterats att nanomaterial som framställts med hjälp av olika bulkmaterial har visat sig ha en cellhämmande verkan mot tjocktarmscancerceller. Specifikt var anticanceraktiviteten huvudsakligen hänförd till den kemiska sammansättningen av växtextrakten och egenskaperna hos nanopartiklarna, inklusive storlek och morfologiska egenskaper hos AgNPs .

4. Slutsats

Slutsatsen är att den här studien beskriver en effektiv, kostnadseffektiv och miljövänlig metod för biosyntesisering av AgNPs med hjälp av Safed musli callus-extrakt. De biofabricerade AgNPs har sfärisk form med en partikelstorlek som varierar mellan 35,1 och 168,0 nm. XRD-mönstret visade att AgNPs förekommer i form av nanokristaller, medan AFM-observationen bekräftade AgNPs sfäriska form. FTIR-spektrumet avslöjade förekomsten av fytokemikalier i callusextrakten som tillskrivs biosyntesen och stabiliseringen av AgNPs. Vidare tyder uppvisandet av antimikrobiell och cancerbekämpande aktivitet hos de biosyntetiserade AgNPs på att de skulle kunna användas vid tillverkningen av nanomedel för terapeutiska tillämpningar, t.ex. antimikrobiella medel, och för behandling av tjocktarmscancer. Totalt sett stöder dessa resultat tydligt den mångsidiga potentialen hos dessa fytofabricerade AgNPs.

Datatillgänglighet

Data som används för att stödja resultaten av denna studie ingår i artikeln.

Interessentkonflikter

Författarna förklarar att det inte finns några intressekonflikter i samband med publiceringen av denna artikel.