Mathis började agera professionellt vid 16 års ålder. Hennes första jobb var en reklamfilm för “Always Slender Pads – Just For Teens”. Hon medverkade i tv-serierna Aaron’s Way och Knightwatch mellan 1988 och 1989. Hennes första huvudroll i en långfilm var Nora i Pump Up the Volume (1990), mittemot Christian Slater, som hon kortvarigt dejtade vid den tiden. Mathis färgade sitt naturblonda hår svart för rollen i ett försök att ändra sin image från söt och oskyldig till viljestark.
Mathis medverkade i tv-filmerna Extreme Close-up, 83 Hours ’til Dawn och To My Daughter 1990. Mathis och Slater hade röstroller i den animerade filmen FernGully: Den sista regnskogen (1992). Därefter medverkade hon i komedin This Is My Life (1992), skriven och regisserad av Nora Ephron, där hon spelade en osäker tonåring. Mathis medverkade i pjäsen Fortinbras i New York i oktober 1992. Super Mario Bros. (1993), där hon spelade prinsessan Daisy från det populära Nintendo-videospelet, var en kassabomb men fick en kultföljare sedan den släpptes.
Mathis träffade skådespelaren River Phoenix på inspelningen av The Thing Called Love (1993) och de två inledde ett förhållande. Hon var tillsammans med Phoenix den 31 oktober 1993, natten då han dog på Cedars-Sinai-sjukhuset av en överdos efter att ha kollapsat utanför Viper Room i West Hollywood. Hon gjorde filmen Jack and Sarah (1995), som spelades in i London, för att komma ut ur landet efter hans död på grund av den överdrivna pressbevakningen.
Mathis medverkade i filmatiseringen av Little Women (1994) och i How to Make an American Quilt (1995), båda med Winona Ryder i huvudrollen. Därefter medverkade hon i The American President (1995), där hon spelade assistenten till USA:s president. Mathis samarbetade med Christian Slater igen, tillsammans med John Travolta, i John Woos Broken Arrow (1996). Hon tog ett drygt år ledigt från skådespeleriet efter att hennes mamma dog 1996 i bröstcancer.
Mathis medverkade senare i American Psycho (2000), en filmatisering av Bret Easton Ellis roman med samma namn från 1991. Hon spelade huvudrollen i Attraction (2000) och i The Simian Line (2001). Hon spelade huvudrollen i TNT:s tv-miniserie The Mists of Avalon (2001). Mathis spelade tillsammans med Thomas Jane i The Punisher (2004). Hon hade en gästroll i tv-serien Lost på ABC som Olivia Goodspeed. Hon spelade Jane Fondas dotter i Broadwayföreställningen “33 Variations”. Hennes indiefilm Lebanon, PA hade världspremiär på SXSW Film Festival 2010. Hon medverkade i en off-Broadway-produktion av pjäsen Love, Loss, and What I Wore på Westside Theatre i New York i oktober 2011.
2013 spelade Mathis psykiatrikern Alice Calvert i CBS tv-serie Under the Dome, baserad på en roman av Stephen King. År 2014 anslöt hon sig till skådespelarna i FX:s skräckdramatiska serie The Strain som Justine Feraldo, en New York City-rådsledamot för Staten Island.
Under 2019 uppträdde Mathis Off-Broadway i rollen som Kate Conlee i Make Believe, en ny pjäs av Bess Wohl som sätts upp på Second Stage Theater. Michael Greif regisserade.
Hennes musikal från 2020, Whisper House, sköts upp på grund av COVID-19-pandemin.