Esofageal skivepitelcancer (ESCC) och dess behandling

Cancer är en livshotande sjukdom som orsakar cirka 8 miljoner dödsfall årligen i världen. Esofaguscancer ligger på sjätte plats på listan över de vanligaste orsakerna till cancerrelaterade dödsfall och bidrar med cirka en halv miljon dödsfall varje år (GLOBOCAN 2012). Bland olika subtyper av esofaguscancer är ESCC den dominerande histologiska typen och är mycket utbredd i mindre utvecklade områden, särskilt vissa regioner i Asien och Afrika. Multimodal behandling erbjuds ESCC-patienter. Patienter i tidiga stadier med resektiva tumörer behandlas genom tumörresektion i förväg, medan avancerade patienter å andra sidan först behandlas med kemoterapi/kemoradiation för att minska tumörstorleken före kirurgisk resektion . Även om denna neoadjuvanta behandling före kirurgi kan ge utmärkt respons i undergrupper av patienter som är känsliga för kemoterapi/kemoradiation, uppvisar ungefär en tredjedel av patienterna fortfarande endast partiell och suboptimal respons. Även för dem som svarar på kemoterapi/kemoradiering kan en del av dem utveckla resistens under den senare delen av behandlingsperioden. För de patienter vars tumörer inte kan avlägsnas, och när tumören är refraktär mot kemoterapi eller strålbehandling, finns det ingen effektiv behandling att tillgå. För att tillhandahålla fler behandlingsalternativ för patienter som inte kan ändras med nuvarande behandlingar föreslås nya behandlingsmetoder som utvärderas i pågående kliniska prövningar för deras effektivitet mot tumörer. Även med alla dessa nya behandlingsmetoder är det fortfarande svårt att bota sjukdomen helt och hållet. Med tanke på detta behövs nya behandlingar snarast.

Användning av tumör xenograft djurmodeller för preklinisk forskning

Det huvudsakliga syftet med att utveckla tumör xenograft djurmodeller för forskning är att överbrygga grundforskning och klinisk forskning och att komplettera användningen av in vitro modellsystem . Tumör xenograft djurmodeller ger en mer sofistikerad plattform för att studera tumörigenesiprocessen i en in vivo miljö. Denna plattform gör det möjligt för oss att få en bättre förståelse för hur vissa onkogener eller tumörundertryckare är inblandade i tumörutvecklingen genom att avslöja deras relaterade signalvägar och sjukdomsmekanismer . Dessutom kan användningen av dessa modeller ge oss ett forskningsverktyg för preklinisk utvärdering av läkemedelsresponsen genom att bestämma anti-tumoreffekterna utöver läkemedelstoxicitet, farmakokinetik och farmakodynamik . Förutom utvärdering av läkemedelsrespons kan dessa modeller också underlätta biomedicinsk avbildningsforskning genom att tillhandahålla ett modellsystem för att testa användbarheten och praktiska egenskaper hos nya tumördetekteringsmetoder eller reagenser.

Möss är de vanligaste djuren för xenograftmodeller för tumörer på grund av flera viktiga fördelaktiga egenskaper, t.ex. att de har ett genom av jämförbar storlek med människans, en kort reproduktionscykel, en stor kullstorlek, låg underhållskostnad och lätt att manipulera . Olika musstammar med unika immunbristbakgrunder används inom cancerforskningen, bland annat athymiska nakenmöss, SCID-möss och NOD/SCID-möss (SCID-möss med en extra nivå av immunbrist). Bland dessa stammar uppvisar NOD/SCID-möss den bästa immunbristen på grund av avsaknad av eller defekt i nästan alla typer av immunceller (B-celler, T-celler, dendritiska celler, makrofager och naturliga mördarceller), följt av SCID-möss som saknar B-celler och T-celler och därefter athymiska nakenmöss utan T-celler . På grund av deras olika nivåer av immunbrist anses olika stammar kunna användas för olika forskningsändamål. Med hänsyn till kostnaderna och egenskaperna hos de olika stammarna används athymic nude-möss och SCID-möss företrädesvis för att implantera humana tumörcellslinjer, medan SCID- och NOD/SCID-möss hellre används för transplantation av humana tumörer.

Högre vanliga tumör xenograft-djursmodeller för ESCC-forskning

Tre typer av tumör xenograft-djursmodeller för ESCC-forskning utvecklas genom att implantera ESCC-celler/-xenografts eller patienttumörer i immunbristande djur, nämligen subkutana, ortotopiska och patientavledda tumör xenograft-modeller (fig. 1). Var och en av dem har sina egna styrkor och svagheter när det gäller modellens egenskaper (tabell 1), etableringsmetoder (tabell 2) och prekliniska användningsområden (tabell 3), vilket gör att de har en unik position för forskning i tidiga, mellersta eller sena skeden .

.

Subkutan tumör xenograftmodell

Subkutan tumör xenograftmodell är en klassisk djurmodell för ESCC-forskning. Denna modell upprättas genom att ESCC-celler/xenografts implanteras under huden på immunbristande djur för att utveckla subkutana tumörer. Förfarandet för att skapa subkutana tumörer är tekniskt sett enkelt, eftersom det endast omfattar nålinjektion av ESCC-celler eller direkt implantation av ESCC-xenografts under huden på djuren. Tillväxten av subkutana tumörer kan utföras på ett icke-invasivt sätt genom att man använder ett elektroniskt kalibreringsinstrument för att mäta de palpabla tumörerna. Dessa tekniska förfaranden för tumöretablering och övervakning kan upprätthålla modellens reproducerbarhet och effektivitet (både tids- och kostnadsmässigt). Trots dessa fördelar har denna modell vissa begränsningar eftersom den inte fullt ut representerar den kliniska situationen. Till exempel är modellen förknippad med minskad tumörheterogenitet eftersom homogena ESCC-cellinjer i de flesta scenarier används som källmaterial. Dessutom växer subkutana tumörer inte i sin ursprungliga tumörmikromiljö, vilket gör dem olämpliga för studier av interaktioner mellan tumör och strömsystem. Med sådana styrkor och svagheter används denna modell främst i tidig forskning för att studera biologin och mekanismen för ESCC-tumörbildning.

Ackumulerande rapporter har visat att det är mycket fördelaktigt att använda den subkutana xenograftmodellen för forskning i tidig forskning genom att använda den för att studera tumöregenskaperna hos ESCC-relaterade molekyler och de sjukdomsmekanismer som är förknippade med dem. Övexpression av microRNA-340, ett microRNA som nedregleras i ESCC-tumörer, i EC9706 ESCC-celler hämmade tillväxtegenskaperna hos dessa celler i en subkutan xenograftmodell för tumörer. Effekten av detta mikroRNA på ESCC förmedlades delvis via dess effekt på ett proteintransferas PSAT1, som i samma studie identifierades som ett direkt mål för mikroRNA-340 . En annan studie visade att subkutana tumörer som härrörde från KYSE-30 ESCC-celler med överuttryck av matrixmetalloproteinas MMP1 växte snabbare än kontrollcellerna. Dessutom uppvisade dessa MMP1-överuttryckande ESCC-celler också metastatiska potentialer. MMP1:s förmåga att främja tumörutveckling och metastasering visade sig bero på dess stimulerande effekt på en tumörframkallande väg som involverar PI3K och AKT . I en separat rapport användes också en xenograftmodell för subkutana tumörer för att avslöja cellulär retinosyrabindande protein 2 (CRABP2) som en tumörsuppressor genom att visa att subkutana tumörer som härstammar från EC109 ESCC-celler som överuttrycker CRABP2 växer långsammare jämfört med kontrollgruppen. Dessa studier visar att denna modell är användbar för att studera ESCC-relaterade molekyler och deras relaterade mekanismer i ESCC.

Förutom användningen av en xenograftmodell för subkutan tumör för tumörbiologiska studier har försök gjorts för att använda denna modell för att undersöka den antitumörmässiga effekten av nya behandlingsmetoder eller föreningar/läkemedel för behandling av ESCC. Subkutantumörbärande möss behandlades för att inducera uttrycket av en prognostisk markör för ESCC, microRNA-375, och mindre tumörstorlek erhölls i slutet av försöket jämfört med kontrollförsöket . Förutom den rutinmässiga användningen för att undersöka nya behandlingsmetoder tillämpades denna modell också för att undersöka anti-tumör-effekten av nya föreningar/läkemedel för att motverka ESCC, t.ex. temsirolimus som för närvarande används för patienter med njurcellscancer . Förutom att denna modell är användbar för testning av anti-tumörgenicitet kan den också användas för att undersöka de kemokänsliga effekterna av testföreningar. Behandling av subkutantumörbärande djur med ginsenosid Rg3, en ingrediens som utvinns ur ginseng, gav bevis för att denna förening har sensibiliserande effekter på två kemoterapeutiska läkemedel, paclitaxel och cisplatin, som vanligen används för ESCC-patienter . Nyligen visades att en ny syrebärare YQ23 har en kemokänsliggörande effekt selektivt på kemoresistenta subkutana SLMT-1 ESCC xenografts, men inte på kemokänsliga HKESC-2 ESCC xenografts, i behandlingsplaner som använder cisplatin eller 5-fluorouracil, som också är traditionella kemoterapeutiska läkemedel som används för ESCC-patienter . Ovanstående studier som undersöker den antitumorala effekten av testföreningar/läkemedel ensamma eller i kombination med vanliga kemoterapeutiska läkemedel som används för ESCC har belyst den prekliniska användbarheten av subkutan xenograftmodell för tumör xenograftmodell för testning av föreningar/läkemedel.

Tillsammantaget är subkutana xenograftmodeller för tumörer, särskilt de som är väl karakteriserade för sin känslighet för kemoterapeutika som för närvarande används för ESCC, värdefulla forskningsverktyg för att studera tumörbiologin och sjukdomsmekanismerna hos ESCC in vivo och för att utföra prekliniska studier om effektivitet mot tumörer (tabell 3).

Orthotopisk tumör xenograftmodell

Orthotopisk tumör xenograftmodell är en alternativ djurcancermodell som används för ESCC-forskning. Denna modell upprättas genom att ESCC-celler/xenografts implanteras i matstrupen hos immunbristande djur för att utveckla ortotopiska tumörer. Förfarandet för att etablera ortotopiska tumörer är mer tekniskt krävande jämfört med de förfaranden som krävs för att etablera subkutana tumörer, eftersom det kräver kirurgi och/eller bedövning av smådjur. Två huvudsakliga tillvägagångssätt används för att implantera ESCC-celler/xenografts i djurens matstrupe, och de skiljer sig åt när det gäller platsen för tumörimplantering. Med den ena metoden implanteras ESCC-celler/xenografts i den övre delen av matstrupen, medan ESCC-celler/xenografts enligt den andra metoden implanteras i den nedre delen av matstrupen i bukregionen nära den gastroesofageala korsningen . Nyligen har vi också rapporterat en jämförelse av överlevnaden mellan djur med ortotopisk tumör som utvecklats i den övre delen av matstrupen och i den nedre delen, och funnit att de med tumör i bukregionen har bättre överlevnad . Även om det är mer tids- och arbetskrävande att etablera ortotopiska tumörer kan denna modell möjliggöra studier av tumörtillväxt i en korrekt tumörmikromiljö som i den kliniska situationen och göra det möjligt att studera interaktioner mellan tumör och strömmande organ. Den lider dock också av samma begränsning som den subkutana modellen genom att den använder ESCC-cellinjer som källmaterial för tumöretablering. En annan stor nackdel med denna modell är behovet av att använda specialiserade avbildningsmetoder, t.ex. in vivo-avbildningssystem i kombination med bioluminescent teknik , för att övervaka tumörtillväxten. Trots dessa begränsningar gör styrkorna i denna modell den till en värdefull djurmodell för användning i forskning i mitten och slutet av forskningsperioden.

Och även om den ortotopiska xenograftmodellen för tumörer erbjuder överlägsna fördelar i jämförelse med den subkutana modellen, förblir dess användning begränsad på grund av de ovan nämnda begränsningarna. Trots dessa brister har ett växande antal rapporter exemplifierat tillämpningen av denna modell för att studera ESCC-tumörgenesen och för att utföra prekliniska tester av anti-tumörgenicitet. När denna modell användes för att avslöja den tumörundertryckande effekten av ett transmembranproteas DESC1 observerades en långsammare tumörtillväxt vid användning av DESC1-uttryckande KYSE-150 ESCC-celler jämfört med kontrollceller . I en oberoende studie där denna modell användes för att undersöka tumörfenotypen hos det tumörrelaterade proteinkinaset AKT, fann man en tydlig tumörundertryckande effekt i samband med knockdown av AKT, vilket innebar att en minskad tillväxthastighet hos ortotopiska tumörer lätt kunde påvisas . Förutom användningen för att studera tumörtillväxt kan denna modell användas för att undersöka mekanismen för tumörinvasion. I en omfattande studie påpekades att en cellytemolekyl CD44H är inblandad i tumörinvasionen på grundval av de invasiva mönster som observerats mellan ortotopiska tumörer som härrör från T.T ESCC-celler och den invasiva motsvarigheten T.T-1 ESCC-celler. T.T-1 ESCC-cellinjen uttryckte en hög nivå av CD44H och härstammade från tumörceller som isolerats från cervikal lymfkörtel i en ortotopisk xenograftmodell med T.T ESCC-celler som härstammar från ortotopiska tumörer. Denna modell används inte bara för att studera tumörtillväxt och invasion, utan kan också användas för att bedöma effekterna av testföreningar på överlevnaden efter behandling. En förlängd överlevnad observerades i ortotopiska ESCC-tumörbärande djur efter behandling med mTOR-hämmaren temsirolimus, för vilken denna hämmare för närvarande används för njurcellscancer .

Generellt sett kompletterar den ortotopiska xenograftmodellen för tumörer det regelbundna användandet av subkutantmodellen för studiet av ESCC genom att ge en korrekt tumörmikromiljö. Dessutom fungerar denna modell som ett oumbärligt verktyg i preklinisk forskning för att undersöka de antitumörala effekterna av testföreningar/läkemedel (tabell 3).

Patientavledd tumör xenograftmodell

Patientavledd tumör xenograftmodell är en mer avancerad djurcancermodell än de ovan nämnda modellerna för ESCC-forskning. Denna modell har etablerats med hjälp av ESCC-tumörer som tagits bort från patienter för att utveckla xenografts av tumörer i immunbristande djur. Patientens tumörer kan implanteras subkutant eller ortotypt. Beroende på var tumören implanteras behåller denna modell också vissa egenskaper som de subkutana och ortotopiska xenograftmodellerna för tumörer. Det är anmärkningsvärt att tumör xenografts som härrör från patienttumörer har bevarade genetiska, histologiska och fenotypiska egenskaper som donortumörerna. Eftersom stromal- och cellkomponenterna i de patientavledda xenografts av tumörer bibehålls på samma sätt som i givartumörerna, kan användningen av denna modell utesluta de nackdelar som är förknippade med användningen av homogena tumörcellinjer. Trots dessa fördelar lider denna modell oundvikligen av flera begränsningar . För att modellen ska kunna upprättas krävs det att man använder sig av resecerade patienttumörer, vilket vissa laboratorier för grundforskning kanske inte har tillgång till denna provkälla. Dessutom är graftningsgraden av patienttumörer för att bilda xenograftsubstans suboptimal och varierar beroende på ett antal faktorer, t.ex. tumörtyper, tumörimplantationsställen, musstammar, tumöregenskaper och patientegenskaper . Även för en patienttumör som framgångsrikt kan engraftas krävs det en lång latenstid för att växa till en xenograft, och ibland kan denna process pågå i så lång tid som sex månader. Ovanstående begränsningar har därför gjort tumöretableringsprocessen till ett kostsamt och arbetsintensivt förfarande. Trots dessa nackdelar ersätter denna modell successivt andra cancermodeller från djur för att användas i forskning på mellanstadiet och i senare stadier, och den är särskilt fördelaktig för preklinisk utvärdering av nya substansers/läkemedels anti-tumörverkan. Denna modell kallas ibland för “kliniska prövningar i en mus” på grund av dess överlägsna förmåga att förutsäga det kliniska svaret på testade föreningar/läkemedel på grund av den stora likheten mellan tumör xenografts och givartumörer.

Med tanke på alla för- och nackdelar kan den patientavledda tumör xenograft-modellen ge oss en forskningsplattform, inte bara för att studera sjukdomsmekanismerna för ESCC, utan också för att underlätta preklinisk läkemedelsscreening. För den sistnämnda tillämpningen används denna modell hellre än subkutana och ortotopiska modeller på grund av dess höga kliniska relevans, vilket stöder dess användning för att utvärdera nya föreningars/läkemedels anti-tumöreffekter. På detta område har enskilda forskargrupper upprättat sina egna samlingar av patientavledda xenograftmodeller med bevarad tumörheterogenitet för screening av läkemedel eller läkemedelskombinationer för ESCC (tabell 4).

De patientavledda tumör xenograftmodellerna med väl karakteriserade molekylära dereguleringar som är vanligt förekommande i ESCC kan användas som ett verktyg för att testa för närvarande använda läkemedel för deras nya användningsområden på ESCC. Denna process är viktig eftersom den kan leda till forskning om nya läkemedel för patienter som är resistenta mot nuvarande läkemedelsbehandlingar. Cisplatin och 5-fluorouracil är två kemoterapeutiska läkemedel som används för ESCC, men det är inte alla patienter som svarar bra på läkemedlen. För att få en bättre förståelse för läkemedelsmekanismen upprättade Zhang et al. en panel av patientavledda xenograftmodeller för tumörer och karakteriserade dem väl med avseende på vanliga genetiska avvikelser som ofta upptäcks i ESCC, t.ex. HER2-uttryck och mutationer av EGFR (epidermal tillväxtfaktorreceptor), K-ras, B-raf och PIK3CA (fosfatidylinositol-4,5-bisfosfat 3-kinas katalytisk subenhet alfa). Genom att använda en panel av xenografts med väl karakteriserad HER2- och PIK3CA-status för att undersöka behandlingseffekten av cisplatin och 5-fluorouracil var tumör xenografts negativa för HER2 och bärande på PIK3CA av vildtyp känsligare för sådan behandling jämfört med HER2-positiva xenografts, oberoende av PIK3CA:s mutationsstatus . Resultaten från denna studie har avslöjat kopplingen mellan tumörens genetiska sammansättning och kemoterapeutiska läkemedelsresponser.

Som en del av användningen av patientavledda xenograftmodeller med definierad genetisk sammansättning för att testa konventionella kemoterapeutiska läkemedel, har dessa modeller använts för att undersöka anti-tumöreffekten av läkemedel som inte används kliniskt för ESCC, t.ex. trastuzumab och lapatinib. Testning av effekten av trastuzumab på patientavledda xenografts visade att HER2-positiv ESCC reagerade på sådan behandling, men inte för dem som hade en samtidig PIK3CA-mutation. Ytterligare behandling av dessa HER2-positiva och PIK3CA-muterade xenografts med AKT-hämmaren AZD5363 gjorde att xenografts återigen reagerade på trastuzumabbehandling. I en annan studie undersöktes lapatinibs sensibiliserande effekt på kemoterapeutiska läkemedel oxaliplatin eller 5-fluorouracil med hjälp av en patientavledd tumör xenograftmodell. Kombinerad behandling av lapatinib med 5-fluorouracil ledde till en kraftigare tillväxthämmande effekt än enbart lapatinib eller dess kombinerade behandling med oxaliplatin . Dessa studier har tydligt visat hur användbara dessa modeller är för preklinisk läkemedelstestning. Viktigt är att sådana tester på tumör xenografts med definierad genetisk bakgrund kan underlätta utvecklingen av precisionsmedicin genom att välja läkemedelsbehandling utifrån tumörernas genetiska dereguleringar.

Patientavledda tumör xenograftmodeller kan efterlikna den genetiska mångfalden och sammansättningen i de kliniska miljöerna på grund av den höga histologiska och patologiska relevansen mellan givartumörer och de etablerade tumör xenografts. Dessa tidigare studier har visat på den prekliniska tillämpningen av dessa modeller för att utvärdera olika läkemedels/föreningars antitumorverkan (tabell 3). De härledda resultaten kan också ge solida bevis som stöder användningen av nya läkemedel/föreningar för behandling av ESCC. Sådana prekliniska tester utgör därför en viktig plattform före kliniska prövningar.