Clostridium botulinum – Botulism (kliniska former). Test för diagnos av botulism. Påvisande av toxin hos patienter, livsmedel, foder, slam eller vattensediment; vattenfåglar, andra prover. Rekommenderade tester: Påvisning av toxin, C. botulinum-kultur, Typat botulinumtoxin; Molekylär diagnostik (PCR).

Karakteristik av Clostridium botulinum och botulinumtoxin/s

Clostridium botulinum är en strikt anaerob grampositiv bacillus, släktet Clostridium, familjen Clostridiaceae, sporfbildande, som producerar ett neurotoxiskt toxin. Denna bakterie finns vanligen i jord och obehandlat sötvatten och sediment (hav, sjöar) och är spridd över hela världen. Under vissa omständigheter kan denna organism kontaminera livsmedel och växa i dem för att producera sina toxiner. Botulism, en allvarlig form av matförgiftning, uppstår när man får i sig livsmedel som innehåller toxinet. Även om denna sjukdom är sällsynt är dödligheten hög. När toxintypen bestämdes bland 1 036 fall som upptäcktes i USA mellan 1899 och 1990 var 384 fall av A-toxin, 106 fall av B-toxin, 105 fall av E-toxin och 3 fall av F-toxin. Ibland kan det förekomma fall som beror på två toxiner, till exempel A och B.

Alla former av botulism hos människor och djur orsakas av absorption av botulinumtoxin som bildas vid förökning av bakterien Clostridium botulinum. Toxinet har en mycket hög toxicitet (neurotoxicitet), så att det utövar sin verkan vid extremt låga nivåer, är värmebeständigt, medan bakteriens sporer är värmebeständiga och överlever i livsmedel som värms upp till över 100 ºC, t.ex. konserver som genomgått värmebehandling. Dessutom kan vissa stammar av C. botulinum, C. butyricum, C. baratii och C. argentinense producera botulinumneurotoxiner.

Det finns sju toxintyper (A – G) som kan särskiljas med hjälp av neutraliseringstester och som är användbara för klinisk och epidemiologi. Typ A, B, E och F är de viktigaste orsakerna till botulism hos människor, medan typ C och D förekommer i fall av botulism hos djur, där de mest drabbade är vilda fåglar och fjäderfä, nötkreatur, hästar och vissa arter av fiskar. Typ A och B är vanligast hos människor och är främst relaterade till kontaminering av hemlagade grönsakskonserver, men i Europa har dessa typer också påträffats i samband med köttprodukter. E-typen (fisk) finns i vattenmiljöer och korrelerar med E-botulismfall i samband med kontaminerad fisk eller skaldjur, och den ökar. F-typen är exceptionell. Typ C delas in i C1 (neurotoxin) och C2 (inte neurotoxin som påverkar kärlpermeabiliteten och enterotoxigena). Typ G produceras av C. argentiniense (isolerad från jord i Argentina, serum från avlidna patienter, även om det är oklart med inblandning).

Toxiner syntetiseras under bakteriens tillväxt som ett inaktivt protein (150 kDa), som frigörs från bakterien under lysis. För att aktivera det bildade toxinet bör det brytas ned till två polypeptidkedjor (50 och 100 kDa).

C. botulinum, kan differentieras i grupper enligt deras odlingsegenskaper, biokemiska och fysiologiska egenskaper. Alla kulturer av typ A och vissa av typerna B och F är proteolytiska. Kulturer av C. botulinum-toxiner som produceras av C och D är inte proteolytiska när de odlas i ett medium med koagulerad äggvita eller koagulerat kött. Alla typer E och vissa av typerna B och F är icke-proteolytiska, men har egenskaper för kolhydratmetabolism som skiljer sig från de icke-proteolytiska grupperna typerna C och D. Stammarna av typ G har inte Det har studerats tillräckligt detaljerat för en effektiv och tillfredsställande karakterisering.

Den optimala temperaturen för tillväxt och toxinproduktion är cirka 35ºC för de proteolytiska stammarna; för icke-proteolytiska stammar är 26-28ºC. Icke-proteolytiska stammar av typerna B, E och F kan producera toxin vid kyltemperaturer (3-4ºC). Toxiner från icke-proteolytiska stammar uppvisar inte maximal toxicitet förrän toxinet aktiveras med trypsin. Toxiner från proteolytiska stammar produceras i allmänhet i sin aktiverade form.

Kliniska former av botulism

Det finns fyra kliniska former av botulism hos människor:

• Matförgiftning (foodborne botulism), som beror på intag av livsmedel som är kontaminerade med Clostridium botulinum, i vilka toxinet bildas.

• Sårbotulism, framkallas genom infektion av sår med Clostridium botulinum och utveckling av toxin in vivo efter odling av bakterierna i såret.

• Spädbarnsbotulism, framkallas genom produktion av toxin i matsmältningskanalen hos små barn som koloniserats av Clostridium botulinum (den vanligaste orsaken är på grund av intag av kontaminerad honung eller majssirap), följt av absorption av toxinet. Dessa patienter kan ha antikroppar mot toxinet.

• Tarmbotulism hos vuxna, orsakad av kolonisering av matsmältningssystemet med Clostridium botulinum hos äldre, följt av absorption av toxinet. Dessa patienter kan ha antikroppar mot toxinet.

I någon av de kliniska formerna av human botulism, och lika i djurbotulism, tränger toxinet in i blodet från mag-tarmkanalen när det intas förformat med ett livsmedel, eller när det produceras av den bakterie som koloniserar matsmältningskanalen (små barn eller vuxna), eller i undantagsfall barn från ett infekterat sår med bakterien. Det finns vissa livsmedel som är mer sannolika än andra att innehålla botulinumtoxin. Livsmedel med ett pH under 4,5 är svårare att vara orsak till botulism eftersom C. botulinum vid detta pH inte kan föröka sig och producera toxin (detta gäller fruktjuicer, ättiksmarinerad mat etc.). Omvänt kan livsmedel med pH lika med eller högre än 4,5 orsaka botulism, eftersom det i dem är möjligt att föröka sig och producera toxin (detta är fallet med kött, fisk, grönsaker, färdigrätter etc.), på alla dessa livsmedel syrefri exponering, som med konserverade eller vakuumförpackade livsmedel, och som har ett pH högre än 4,6. Exempel på farliga livsmedel: saltad skinka, rökt, konserverad fisk eller grönsaker (som genomgått en värmebehandling som inte är tillräcklig för att döda sporerna) osv. De konservburkar som är kontaminerade med C. botulinum är vanligtvis böjda, även om detta inte sker med typ E.

Toxinet som absorberas binder irreversibelt till de neuromuskulära korsningarna i motoriska nervceller, vilket förhindrar frisättning av acetylkolin och orsakar slapp förlamning eller muskelsvaghet.

Kliniskt kännetecknas det av akut slapp förlamning, som vanligen börjar med bilateral inblandning av kranialnerverna, vilket påverkar musklerna i ansiktet, huvudet och svalget, och sedan sjunker symmetriskt nedåt för att påverka bröstmusklerna och lemmarna. Döden, när den inträffar, beror på andningssvikt genom förlamning av tungan och svalgmusklerna som blockerar de övre luftvägarna, eller genom förlamning av diafragma och interkostalmusklerna. Av denna anledning bör patienterna få botulinumantitoxin och respiratorisk intensivvård behövs.

Diagnostiska tester för botulism

Detektion av botulinumtoxin i prover eller livsmedel utan odling (se rekommenderat prov i testdelen “Test som erbjuds av IVAMI och prov som krävs”).

Detta rekommenderas hos en patient med kliniska tecken på botulism.

Detektion av botulinumtoxin kan utföras i en vätska, t.ex. serum från blod. Det kan också påvisas från resterna av livsmedel som ätits och som har orsakat ett fall eller ett utbrott av botulism. För att utföra testet med hjälp av matrester är det nödvändigt att erhålla ett extraktfiltrat från det. I fall av spädbarnsbotulism eller tarmbotulism kan förekomsten av toxin påvisas i avföring från barn eller patienter, men anser att det är mer tillrådligt att utföra en preliminär odling av avföring (se nedan ). Påvisande av botulismtoxin i något av fallen utförs genom inokulering i mikrometrar som utvecklar paralytiska symtom, följt av döden, om de inokuleras med botulinumtoxin. För att bekräfta att mössen har dött av det inokulerade botulinumtoxinet krävs ett neutraliseringstest, som bekräftar att det fanns botulinumtoxin och identifierar vilken typ av botulinumtoxin som fanns. Neutraliseringstestet utförs med den inokulerade produkten (serum från människor eller djur, extrakt från intagen mat, …) mot specifika antisera av varje typ av toxin.

Inför neutraliseringstestet är det nödvändigt att beräkna den minsta dödliga dosen (MLD). Således beräknar vi den maximala (högsta) utspädning som orsakar de infekterade djurens död, och den inokulerade volymen har orsakat djurens död innehåller en dödlig minimidos (LMD).

För att identifiera typen av toxin, när man väl känner till “Minsta letala dosen”, ställs denna inför olika antitoxin botulinumtyp antisera. Dessa blandningar kommer att inokuleras i lika stor volym till försöksmöss och de som överlever, har inokulerats med blandningen av “minsta dödliga dos” plus antiserum mot en typ som har kunnat neutralisera.

Detektion av toxin i prover/produkter efter förkultivering (se Rekommenderat prov efter i det test som erbjuds av IVAMI och prover som krävs).

När bakterien Clostridium botulinum, som producerar toxinet, kan påträffas i provet rekommenderas föregående odling, för att undersöka toxinet efter att ha odlat provet. Detta är fallet med avföring från en patient med spädbarnsbotulism eller tarmbotulism, rester av livsmedel som ätits och i vilka bakterierna förökat sig (t.ex. burkkonserver), ett misstänkt livsmedel som kan innehålla bakterien (t.ex. en utbuktande burkkonserver), ett livsmedel som är under kontroll för att utesluta förekomsten av denna bakterie (t.ex, korv, skinka, konservburkar), eller andra prover såsom sötvattenslam eller akvatiska marina sediment etc. från områden där dödlighet har observerats hos sjöfåglar.

Under odling i laboratoriet, i lämpliga odlingsmedier, produceras toxinet om det finns en bakterie och att erhålla ett odlingsfiltrat kan vara användbart för att undersöka förekomsten av denna bakterie, genom att inokulera filtratet till möss. Om inokulerade möss påverkas, ange den sannolika förekomsten av Clostridium botulinum i provet eller tillväxten i kulturen. Möss kan dock ha dött av en annan orsak, så nödvändigt, innan rapporten utfärdas, måste kontrolleras att de verkligen har dött för att ha blivit inokulerade med botulinumtoxin.

För att bekräfta närvaron av botulinumtoxin i kulturen kan neutraliseringsförsök med hjälp av specifika antisera för varje typ av botulinumtoxin (neutraliseringsförsök) utföras, eller detektering av närvaron av Clostridium botulinum-gener och dess typ i kulturmediet (molekylär detektering genom PCR).

Neutraliseringstestet utförs med det inokulerade provet (odlingsfiltrat) mot specifika antisera för varje typ av toxin.

För steget med neutraliseringstestet är det nödvändigt att beräkna den minsta dödliga dosen (MLD). Således beräknas den (högsta) maximala utspädning som orsakar de inokulerade djurens död, och den inokulerade volymen har orsakat djurens död innehåller en minsta dödliga dos.

För att identifiera typen av toxin, när “minsta dödliga dosen” väl är känd, utförs konfrontation den minsta dödliga dosen med olika typer av anti-botulinumserum. Dessa blandningar inokuleras i lika stor volym till försöksmöss och de som överlever har inokulerats med blandningen av “minsta dödliga dos” plus antiserum mot en typ som har kunnat neutralisera.

Den molekylära påvisningen genom PCR gör att man undviker den tid som krävs för att beräkna den minsta dödliga dosen (MLD) och neutraliseringstestet.

Detektion av antikroppar mot botulinumtoxin (se rekommenderat prov efter i avsnittet Test som erbjuds av IVAMI och erforderliga prover)

• Patienter som behandlas med utspätt botulinumtoxin, t.ex. de som får botox för estetiska eller medicinska behandlingar (e. gr. smärta på grund av ansiktsneuralgi), för att påvisa förekomst av antikroppar som förhindrar dess verkan.

• Patienter med misstänkt spädbarnsbotulism eller vuxenbotulism som inte har kunnat hitta bakterien Clostridium botulinumtoxin i avföring eller serum.

• Vaccinerade personer som är intresserade kontrollera skyddets status.

Clostridium botulinumtoxin har i mycket höga spädningar använts genom lokal administrering för att behandla spastiska processer. Dessa processer har visat sig vara ett användbart botemedel. Dessa processer är vanligtvis kroniska spastiska vilket kräver att toxinet administreras permanent. Därför kan resistens uppstå under behandlingen på grund av progressiv immunisering av patienten under hela behandlingen, i vilket fall effekten skulle vara begränsad. För att upptäcka denna immunisering krävs en noggrann och känslig mätning av förekomsten av antikroppar mot botulinumtoxin A och/eller B.

Den accepterade referensmetoden för att påvisa och kvantifiera antikroppar mot botulinumtoxin är neutraliseringstestet på möss (Mouse Neutralization Assay), där en utspädning av botulinumtoxin, kvantifierad med Lethal Dose 50% för mus (DL50), blandas med olika bas 2- eller bas 4-utspädningar av serum/plasma, och efter inkubation inokuleras var och en av dem intraperitonealt till grupper av möss. Den högsta utspädning av testserum som minskar toxiciteten motsvarar antikroppstitern mot motsvarande botulinumtoxin. Denna utspädning jämfört med en internationell standard gör det möjligt att erhålla resultat i internationella enheter (IU/mL) (1 IU definieras som den mängd antikroppar som neutraliserar 10 000 LD50 av toxinerna A eller B, eller 1 000 LD50 av typ E). Den mängd toxin som används i testerna är en mängd som neutraliseras av 0,02, 0,005 och 0,0125 IU/mL antitoxin för typ A, B respektive E (Hatheway et al. 1984). Sera som skyddar mössens titer på 1: 4 rapporteras som <0,08 IU / mL för typ A, eller <0,02 IU / mL för typ B. Testet är arbetskrävande, dyrt och långvarigt att utföra, så alternativ har sökts enmzimimoinmunoanálisis baserade metoder (ELISA) med hjälp av mikroplattor belagda med botulinumtoxin. De värden som erhålls med ELISA korrelerar dock ibland inte helt med neutraliseringstestet på möss.

För steget med neutraliseringstestet är det nödvändigt att beräkna den minsta dödliga dosen (DLM) av toxin. Beräkningen av den minsta dödliga dosen utförs genom bas 10-spädning av kulturfiltratet, spädning av hälften med fysiologisk koksaltlösning för att få samma spädning som toxinet blandat med serum eller plasma från patienten och inokulering av varje spädningsblandning till laboratoriemöss. På så sätt beräknas den (högsta) maximala utspädning som leder till att de infekterade djuren dör. Den inokulerade volymen som orsakat djurens död innehåller en minsta dödlig dos (MLD).

När den minsta dödliga dosen är känd, beräkna den minsta icke-dödliga dosen (dmnm) som motsvarar den minsta mängd toxin i närvaro av en konstant mängd antitoxin som inte dödar inokulerade möss. Denna mängd toxin neutraliseras av motsvarande enheter anti-A antitoxin eller anti-B antitoxin. Minsta icke-dödliga dos kallas detta eftersom det är den minsta mängd toxin som inte leder till att mössen dör i närvaro av antitoxin .

Tester som erbjuds av IVAMI och prover som krävs:

• Detektion av botulinumtoxin i människofall eller utbrott av livsmedelsburen botulism:

• • Patientserum (minst 5 ml) som senast erhållits för inokulering av möss och toxintypning, om mössen påverkats.

• • I fall av spädbarnsbotulism eller tarmbotulism kan botulinumtoxinet påvisas i avföring från barn/patienter, men vi rekommenderar mer tillrådligt att utföra en preliminär odling av avföring.

• Detektion av toxin och/eller Clostridium botulinum i livsmedel som intas, misstänks orsaka botulism eller livsmedel som är föremål för kontroll

• • Prov av det misstänkta eller kontrollerade livsmedlet (minst cirka 100 gram rekommenderas) för att förbereda ett prov som är avsett för inokulering av möss och för att detektera närvaron av det förbildade toxinet i livsmedel, samt för att utföra en odling för att erhålla filtratet för att inokulera möss och fastställa om det fanns toxinproducerande bakterier i provet; Om du bara har rester av livsmedel rekommenderas det att du skickar hela den tillgängliga mängden.

• Detektion av Clostridium botulinum i fall av spädbarnsbotulism eller tarmbotulism

• • Fekalier i fall av spädbarnsbotulism eller tarmbotulism på grund av tarmkolonisering (10 g), för odling och toxinbestämning i odlingsfiltrat genom inokulering av möss.

• Detektion av Clostridium botulinum vid sårbotulism

• • Sårexsudat vid misstanke om sårbotulism, för odling och toxinpåvisning i odlingsfiltrat genom inokulering av möss. Om provet transporteras aerobt kan Clostridium botulinum ha inaktiverats, och det vore lämpligare att utföra ett molekylärt test för att kontrollera förekomsten av Clostridium botulinum-gener och, om det är positivt, identifiera typen av botulinumtoxin genom att påvisa gener som motsvarar varje typ av toxin.

• Detektion av Clostridium botulinum i prover av sötvattenslam eller akvatiska marina sediment och andra produkter som inte ingår i de tidigare avsnitten

• • 100 g prover ungefär för att utföra en odling för tillväxt av Clostridium botulinum och erhålla ett odlingsfiltrat för att inokulera möss.

• Detektion av antikroppar mot botulinumtoxin i serum eller plasma

• • Serum eller plasma (ca 10 mL), för att testa neutraliseringsantikroppar i serum eller plasma mot olika toxiner som finns tillgängliga i laboratoriet. Detta test är av intresse för att fastställa förekomsten av specifika antikroppar hos personer som behandlats med botulinumtoxin, hos patienter med misstänkt spädbarnsbotulism, hos vuxna som inte har kunnat hitta bakterierna i avföringen eller hos vaccinerade personer för att kontrollera skyddets status. I fall av personer som behandlats med botulinumtoxin Det ska anges vilken typ av toxin som administrerats till patienten.

Tid för rapportering av resultat (TAT)

• Vi kan inte ge exakta tider. Om testet endast avser påvisande av toxin genom inokulering av möss och resultatet är negativt, är resultatrapporten högst en vecka. Om testningen innefattar odling av provet och sedan påvisande av det toxin som tillverkats genom inokulering av ett kulturfiltrat från möss, skulle tiden vara två veckor. Om något av dessa tester musinokulering, extrakt från ett prov eller kulturfiltrat, var positivt, bör neutraliseringstest utföras på möss för att bekräfta att det är botulinumtoxin och identifiera dess typ genom neutraliseringstester, är färdigställningstiden 15 dagar.

• Realtids-PCR-testerna är rapporten i 3 eller 4 dagar.

Formulär med produktegenskaper och valda tester

• Om man ansöker om att få utföra tester med produkten måste man lämna in en skrivelse där produktegenskaperna och de valda testerna som ska utföras med det skickade provet anges.

Provvolym

• Se i varje enskilt fall, beroende på vilken typ av tester som erbjuds av IVAMI.

Lagringsförhållanden och transport av prover

• De sänds på de villkor som provet vanligen finns, skyddat för transport. När det gäller prover som kan sönderdelas eftersom det är kontaminerat med bakterier, eller av sin egen organiska (färskvaror, serum från djur eller människa, avföring, slam, … …), måste proverna lagras och skickas frysta, eller åtminstone under de förhållanden som säkerställer kylning under transporten (med provbehållaren i en låda -expanderad polystyren- (vit kork) med kylförpackningar frysta. Observera: denna organism utgör i sig själv inte någon risk för kontaminering genom biologisk exponering.

Kostnad för testning

• Toxindetektion i mänskliga fall/utbrott av livsmedelsburen botulism

• • Musinokulering med serum från patienten eller extrakt från intagen mat ………………………………. ……………………………………………………………………………………………………………Rådfråga [email protected]

• • Om det är positivt, bekräftande test för neutralisering och identifiering av typen av toxin …………….. …………………………………………………………………………………………………………..Consult [email protected] .

• Detektion av toxin och/eller Clostridium botulinum i livsmedel som intas, misstänks orsaka botulism eller livsmedel som är föremål för kontroll

• Detektion av Clostridium botulinum i fall av spädbarns- eller tarmbotulism

• • Optionellt: Möss inokulationstest med serum eller extrakt från intagen mat ………………………………….. ……………………………………………………………………………………………………………Consult [email protected]
  • Rekommenderas. Odlingstest, följt av inokulering av möss med odlingsfiltrat ………………………….. …………………………………………………………………………………………………………..Consult [email protected]
  • Om det är positivt, bekräftande test för neutralisering och identifiering av toxintyp …………………….. …………………………………………………………………………………………………………..Consult [email protected]

• Detektion av Clostridium botulinum vid sårbotulism

• • Kulturtest, följt av inokulering av möss med kulturfiltrat ……………………. Rådfråga [email protected]
  • Om det är positivt, bekräftande test för neutralisering och identifiering av toxintyp …………….. …………………………………………………………………………………………………………..Rådfråga [email protected]

• Detektion av Clostridium botulinum i prover av slam/färskvatten eller marina sediment och andra produkter som inte ingår i de föregående avsnitten

• • Kulturtest, följt av inokulering av möss med kulturfiltrat ……………………. Rådfråga [email protected]
  • Om det är positivt, bekräftande test för neutralisering och identifiering av toxintyp ………………. …………………………………………………………………………………………………………..Rådfråga [email protected]

• Detektering av anti-botulinumtoxin i serum eller plasma (avser en typ av antikropp, så det måste anges vilken typ av toxin som administrerats till personen) ……………………………………………….. Consult [email protected]