Wood Frog Freezing Survival
Winter Habitat
Trädgrodan (Rana sylvatica) lever i skogar som sträcker sig från Appalacherna till de maritima provinserna och västerut till norra Alaska, även till polcirkeln. Dess övervintringsplats är en grund grop i skogsgolvet, långt innanför frostzonen, som överlagras av löv och annat organiskt detritus. Våra studier i södra Ohio tyder på att skogsgrodor utsätts för flera frysepisoder som vanligtvis varar i flera dagar och utsätter grodorna för temperaturer som sjunker så lågt som -2° till -4° C. I nordligare regioner upplever de dock troligen mycket lägre temperaturer och längre perioder av frost.
Frysningens igångsättande
Vissa mekanismer säkerställer att skogsgrodor fryser utan att superköla i stor utsträckning. För det första kan is som omger grodan, på grund av amfibiehudens mycket genomsläppliga natur, omedelbart utlösa frysning av kroppsvätskorna. Dessutom finns det i grodans vinterhärbärge ett överflöd av isbildande ämnen, t.ex. olika mineralpartiklar, organiska syror och vissa mikrober, som kan få grodan att frysa. Laboratorieförsök tyder på att intag av dessa ämnen främjar isbildning hos frystoleranta grodor. Faktum är att flera bakteriestammar som uttrycker en stark isbildande aktivitet har odlats från tarmarna hos vinterinsamlade skogsgrodor, vilket tyder på att sådana bakterier finns kvar under hela vinterdvalan (Lee et al. 1995). Inokulering av is eller iskärnor i vintermiljön är förmodligen den primära mekanism som initierar frysning hos amfibier; det finns inget behov av iskärnproteiner eller andra endogena iskärnor, vilket finns hos vissa ryggradslösa djur (Costanzo et al. 1999).
Freeze/Thaw Stresses
Uttrycklig frysning stelnar vävnader, stoppar kärlcirkulationen och berövar cellerna syre. Eftersom is endast bildas i extracellulära utrymmen dras vatten inuti cellerna osmotiskt utåt där det ansluter sig till det växande isgitteret. Under denna process kan cellerna krympa avsevärt, vilket kan leda till skador på membran och strukturella stödsystem. Makromolekyler och lösningsmedel trängs i en minskande lösningsvolym, vilket kan få negativa konsekvenser. Isbildning i kroppsvätskor innebär också ett hot om mekanisk skada från det växande isgitteret, särskilt i kompakta och starkt strukturerade vävnader och organ. Isfronter kan skära av och separera vävnader och störa intercellulära kommunikationssystem. Vid upptining bildas stora pooler av utspädd vätska i extracellulära utrymmen. Cellvolym, hydroosmotisk balans och energistatus måste återställas.
Frystoleransförmåga
Laboratoriestudier har visat att skogsgrodor kan överleva: (a) frysning av upp till 65-70 % av kroppsvattnet, b) en lägsta kroppstemperatur på -6 °C och c) oavbruten frysning i ≥ 4 veckor. Frystoleransen varierar med årstiderna eftersom grodorna är mest tåliga under vintern. En sådan säsongsvariation i frystoleranskapaciteten kan delvis återspegla förändringar i den mängd kryoskyddsmedel som kan produceras. Överlevnaden är beroende av långsam frysning så att de kryoskyddande mekanismerna kan uttryckas mer fullständigt.
Frysningsåterhämtning
Rekonvalescensen är anmärkningsvärt snabb, med grundläggande fysiologiska och beteendemässiga funktioner som vanligen återvänder inom flera timmar efter upptining (länk till video med låg bandbredd/hög bandbredd; länk till NOVA scienceNOW-reportaget).I samarbete med Jack R. Layne, Jr. (Slippery Rock University) har vårt arbete visat att återhämtningsdynamiken kännetecknas av en sekventiell återställning av grundläggande till successivt mer komplexa funktioner. Hjärtat börjar till exempel slå igen redan innan isen i kroppen har smält helt och hållet, och lungandning och blodcirkulation återställs strax därefter. Kontraktionskraften i bakbensmusklerna återkommer 1-2 timmar efter upptining, medan funktionen hos den innerverande ischiasnerven återställs inom cirka 5 timmar. Bakbens retraktion och rätningsreflexer återkommer flera timmar senare och grodorna uppvisar vanligen normala kroppshållningar och koordinerade motoriska funktioner inom 14-24 timmar. Beteenden av högre ordning, såsom parningsdrift och uppvaktningsbeteende, återställs inte förrän åtminstone flera dagar senare (Costanzo et al. 1997).
Anpassningar för frystolerans
En reaktion som främjar frystolerans hos frystoleranta grodor är omfördelningen av upp till 60 % av det vatten som normalt finns i vävnaderna. När man dissekerar en frusen skogsgroda ser man att en stor del av isen är instängd i lymfsystemet och i coelom, där den kan bildas utan att skada känsliga vävnader och organ (Lee et al. 1992).
Frystolerans främjas också av den snabba syntesen av glukos från leverns glykogen och distributionen av detta kryoskyddande medel till celler i hela kroppen. Den ackumulerade glukosen förbättrar tydligen cellernas, vävnadernas och organens överlevnad eftersom experimentell tillförsel av ytterligare glukos till grodan ökar dess frystolerans (Costanzo et al. 1993). En av glukosens primära funktioner är att höja det osmotiska trycket i kroppsvätskorna, vilket i sin tur minskar mängden is som bildas vid en given temperatur. Glukos som transporteras in i cellerna fungerar som en osmolyt, vilket minskar graden av cellkrympning vid frysning, och fungerar också som ett jäsbart bränsle som kan metaboliseras i frånvaro av syre. Skogsgrodan använder också urea som ett kryoskyddsmedel. Till skillnad från glukos ackumuleras urea under hösten och den tidiga vintern och är redan lokaliserad i cellerna när frysningen börjar. Vissa bevis tyder på att urea är effektivare än glukos när det gäller att förhindra kryoskador (Costanzo och Lee 2005).
Aquaporiner (AQP) och underlättande ureatransportörer (UT) är två transportproteiner som har involverats i ett brett spektrum av fysiologiska roller i olika organismer. Nyligen har dessa proteiner hittats i en rad olika anurier, men deras fysiologiska betydelse är ännu inte helt klarlagd. För att belysa betydelsen av AQPs och UTs för osmolytebalansen i övervintrande grodor undersöker vi uttrycket av dessa proteiner i grodor med varierande grad av terrestrialism. Dessutom mäter vi säsongsvariationer i uttrycket, liksom förändringar i uttrycksnivåerna som svar på vinterrelaterade påfrestningar, hos skogsgrodan.