Abstract

Effekterna av zink, magnesium och kalcium i seminplasma på tiden till graviditet (TTP) hos friska par, på konventionella spermaparametrar och parametrar för datorassisterad spermaanalys (CASA) har utvärderats. Lokaliseringen av chelaterbara zinkjoner i seminalplasma och spermatozoer bedömdes med autometallografi (AMG). Skillnader i lokaliseringen av chelaterbar zink i prover med hög och låg total zinkhalt utvärderades. Spermaprover från 25 par med kort TTP och 25 par med lång TTP genomgick konventionell spermaanalys, CASA, zink- och magnesiummätningar med induktivt kopplad plasmamasspektrometri och kalcium med flamatomabsorptionsspektrometri. Kationerna var starkt interkorrelerade, men ingen korrelation med TTP eller konventionella spermaparametrar hittades. Spermaprover med höga zinkkoncentrationer uppvisade statistiskt signifikant sämre motilitet bedömd med CASA-parametrarna rakhetshastighet och linjäritet än prover med låg zinkhalt. Kalciumkoncentrationen uppvisade också statistiskt signifikanta skillnader för samma parametrar, men effekten avlägsnades genom att ange zinkkoncentrationen i en multipel regressionsmodell. Spermaprover med hög total zinkhalt uppvisade starkare färgning av seminalplasman vid AMG. Det föreslås att höga seminala zinkkoncentrationer har en undertryckande effekt på spermatozoernas progressiva motilitet (`kvalitet av rörelse’), men inte på procentandelen motila spermatozoer (`kvantitet av rörelse’).

Introduktion

Det totala zinkinnehållet i sperma från däggdjur är högt, och zink har visat sig vara avgörande för spermatogenesen. Brist på zink är förknippad med hypogonadism och otillräcklig utveckling av sekundära könsegenskaper hos människor (Prasad, 1991) och kan orsaka atrofi av de seminifera tubuli hos råtta och därmed misslyckande i spermatogenesen (Millar et al., 1958; Underwood, 1977; Endre et al., 1990). Höga zinkkoncentrationer har rapporterats sänka syreupptaget i spermiecellen (Huacuja et al., 1973; Foresta et al., 1990) och den albumininducerade akrosomreaktionen (Foresta et al., 1990). Huvudstjärtans fastsättning/avskiljning och kärnkromatinkondensering/dekondensering påverkas också av seminalzink (Kvist, 1980; Bjorndahl och Kvist, 1982). Det har funnits motstridiga rapporter om effekten av seminalt zink på spermiernas rörlighet (Stankovic och Mikac-Devic, 1976; Danscher et al., 1978; Caldamone et al., 1979; Lewis-Jones et al., 1996). Det har visats att kelering av zinkjoner påverkar spermiernas rörlighet (Saito et al., 1967; Danscher och Rebbe, 1974), och det har föreslagits att biotillgängligt zink som är bundet till vesikulära proteiner med hög molekylvikt snarare än totalt seminalt zink bör vara ett mått på effekten av zink på spermiernas funktion (Bjorndahl et al., 1991; Carpino et al., 1998).

Denna studie fokuserar främst på zink. Sambandet mellan zink i sperman, och i viss mån magnesium och kalcium, och tiden till graviditet (TTP) hos friska par utvärderades. Dessutom bedömdes korrelationen mellan dessa tvåvärda katjoner och konventionella spermaparametrar och parametrar för datorstödd spermaanalys (CASA).

Autometallografi (AMGZn) är en histokemisk metod för detektion av zinkjoner och löst bundna zinkjoner (chelaterbart zink) i vävnad. Skillnader i zinkjonernas lokalisering på ljusmikroskopisk och elektronmikroskopisk nivå i spermatozoer och seminalplasma från män med högt totalzink och lågt totalzink undersöktes.

Material och metoder

Studiepopulation

Totalt 430 par rekryterades bland 52 255 medlemmar i fyra fackföreningar. Spermaprover togs från de 430 paren, motiliteten bedömdes manuellt och med CASA (se senare) och proverna förvarades frysta (-20°C) fram till vidare analys. Par utan tidigare reproduktiv erfarenhet rekryterades när de slutade med preventivmedel och följdes under minst sex fullständiga menstruationscykler eller tills graviditet konstaterades . Av de 430 paren valdes 50 par som blev gravida ut för denna studie: de 25 paren med den kortaste TTP (S-TTP, median 1 månad, intervall 1-2 månader) och de 25 paren med den längsta TTP (L-TTP, median 10 månader, intervall 7-28 månader). Spermaprover från dessa 50 par utsattes för nedanstående analyser.

Konventionella spermaegenskaper

Semansprover erhölls genom onani i 50 ml sterila polystyrenburkar efter rekommenderade 3 dagars abstinens. Efter att proverna blivit flytande analyserades de i rumstemperatur enligt Världshälsoorganisationens kriterier (1992).

Volymen mättes i ett 10 ml graderat Falcon-glasrör (0,1 ml noggrannhet). Manuella bedömningar av spermiernas rörlighet utfördes i en Makler-räkningskammare (Sefi Medical Instruments, Haifa, Israel). Varje påträffad spermatozon graderades enligt följande: a: snabb progressiv motilitet, b: långsam eller trög progressiv motilitet, c: icke-progressiv motilitet, d: immotilitet. Minst 2×100 poängsättningar utfördes. Om skillnaden mellan två på varandra följande räkningar översteg 10 % gjordes två nya räkningar. Procentandelen rörliga spermier definierades som grupperna `a + b + c’. Koncentrationen mättes i en Makler-räkningskammare och morfologin klassificerades enligt Tygerbergs “strikta” kriterier som beskrivs av Kruger et al. (1986) på lufttorkade utstryk fixerade i etanol och eter, färgade med Papanicolaou-teknik (Världshälsoorganisationen, 1992). Bedömningen av morfologin utfördes av en enda utbildad laboratorietekniker. Spermiernas livsduglighet bestämdes på eosin-negrosinfärgade utstryk.

Datorassisterad spermaanalys

Material för CASA erhölls på följande sätt: 4,5 μl färska, välblandade spermatozoer överfördes med en pipett till en Maklerräkningskammare med ett djup på 10 μm. Provet placerades i ett Olympus BH-2 fas-kontrastmikroskop (Olympus Denmark A/S, Glostrup, Danmark) med en värmeplatta (37 °C) vid ×200 förstoring. En Sony-videokamera DXC-107 (Sony Corp., Tokyo, Japan) överförde bilderna till en Sony PVM-1440QM färgvideomonitor (Sony Corp., Tokyo, Japan). Inspelningar av bilderna gjordes på en JVC HR-D560EG/E videokassettbandspelare (JVC Victor Company of Japan, Tokyo, Japan). Inspelningarna analyserades senare på en Hobson Sperm Tracker (Hobson Tracking Systems Ltd, Sheffield, Storbritannien) med en förvärvsfrekvens på 25 Hz, en spårningstid på 2 s (totalt 50 bilder) och ett synfält på 300×300 μm (vilket gör det möjligt att upptäcka alla hastighetsvärden i rak linje på upp till 150 μm/s). 100 spermier analyserades per prov.

Följande parametrar härleddes från analyserna: kurvlinjär hastighet (VCL), rätlinjig hastighet (VSL), linjäritet (LIN), genomsnittlig banhastighet (VAP) och amplitud för lateral huvudförskjutning (ALH).

Bestämning av zink, magnesium och kalcium i sperma

Seminal zink, magnesium och kalcium mättes i alla 50 prover. Zink- och magnesiumkoncentrationer i sperma bestämdes med induktivt kopplad plasmamasspektrometri (ICP-MS). Instrumentet var en PQ2+ från Fisons Elemental (Winsford, Cheshire, Storbritannien). En alikvot på 20 μl späddes 100 gånger med en lösning som innehöll 5 g/l 25 % ammoniak (ARISTAR; Merck, Poole, Storbritannien), 0,5 g/l EDTA (Janssen Chimica, Geel, Belgien) och 0,5 g/l Triton X-100 (Sigma, St Louis, MO, USA) i 18 MW Milliporevatten. Som intern standard tillsattes scandium (AccuStandard, New Haven, CT, USA) till en slutkoncentration på 100 μg/l. Alla prover har beretts i två exemplar. Kalibreringen utfördes med hjälp av blankprover till vilka zink och magnesium (AccuStandard) hade tillsatts till slutkoncentrationer på 1, 2 och 3 mg/l, vilket motsvarar koncentrationer på 100, 200 och 300 mg/l i de ursprungliga spermaproverna. Denna analys utfördes i peak jumping mode med mätningar vid 24Mg, 66Zn och 45Sc.

Bestämning av kalcium gjordes i samma preparat med hjälp av flamatomabsorptionsspektrometri (FAAS). Instrumentet var en Perkin-Elmer 306 (Norwalk, CT, USA). Kalibrering utfördes för koncentrationer som motsvarar 100, 200 och 400 mg/l i de ursprungliga spermaproverna. Prover med höga kalciumkoncentrationer späddes ytterligare tre gånger för att hamna inom kalibreringskurvan.

Detektionsgränserna, beräknade som tre gånger standardavvikelsen för 10 blanka prover som framställdes vid samma tillfälle som proverna, var 1 mg/l för zink, 3 mg/l för magnesium och 2 mg/l för kalcium (uttryckta som koncentrationer i de outspädda spermaproverna). De totala variationskoefficienterna i bestämningarna, beräknade utifrån resultaten av dubbelanalyserna, var 18 % för zink, 32 % för magnesium och 17 % för kalcium.

Förberedelser gjordes också för bestämning av zink med flamatomabsorptionsspektrometri (FAAS) i tio av proverna. Linjär regressionsanalys av ICP-MS- och FAAS-resultaten gav en lutning på 0,79 (95 % konfidensintervall: 0,58-1,00), ett intercept på 13 μg/l och r2 på 0,90. De något högre resultaten för ICP-MS-analyserna var således inte statistiskt signifikanta.

Autometallografisk (AMG) utveckling av spermautstryk för ljusmikroskopisk analys

Fem prover med hög (242-308 mg/l) och fem med låg (38-57 mg/l) zinkhalt, bestämda med hjälp av ICP-MS, inkuberades i 0,5 % natriumsulfid (Bie & Berntsen) i 30 minuter för att skapa zinksulfidgitter. Smärken av ejakulat/sulfidlösningen gjordes på Farmer-sköljda glasobjektsglas. Utstrykningarna lufttorkades, fixerades i 3 % glutaraldehyd (Bie & Berntsen) i 30 minuter och placerades i 0,1 M fosfatbuffert i 3×2 minuter och en gång i destillerat vatten i 2 minuter.

Utstrykningarna framkallades sedan med AMG för att silverförstärka zinksulfidgitterna. Framkallningsmedlet bestod av 60 ml filtrerad gummi arabicumlösning (1 kg löst i 2 l destillerat vatten; Bidinger A/S, Århus, Danmark), 10 ml natriumcitratbuffert och 0,85 g hydrokinon (Merck, Darmstadt, Tyskland) löst i 15 ml varmt, destillerat vatten. Omedelbart före användning tillsattes 0,11 g silverlaktat (Fluka, Buchs, Schweiz) i 15 ml destillerat vatten och lösningen blandades noggrant.

Färrsköljda burkar som innehöll spermautstrykningarna placerades i ett vattenbad vid 26 °C och överfördes till en ljustät låda. Den nyberedda AMG-utvecklaren hälldes i burkarna och utstrykningarna utvecklades i 30 min i den mörka lådan.

Efter utveckling sköljdes utstrykningarna i rinnande avjoniserat vatten i 10 min, placerades i 5 % natriumtiosulfat i 5 min, sköljdes med rinnande avjoniserat vatten i 2 min, postfixerades med 70 % etanol i 30 min och sköljdes slutligen med rinnande avjoniserat vatten i 2 min. Motfärgning utfördes med en 0,1 % vattenlösning av toluidinblått, pH 4,0 (1 g toluidinblått i 1000 ml buffert: 614,5 ml 0,1 M citronsyramonohydrat och 385,5 ml 0,2 M di-natriumvätefosfatdihydrat; Merck, Darmstadt, Tyskland). Utstrykningarna placerades i 2 × 2 min i destillerat vatten, 3 × 3 min i 99 % etanol, 3 × 3 min i xylol och monterades slutligen med DEPEX (Merck, Darmstadt, Tyskland).

Förberedelser av spermautstrykningar för elektronmikroskopisk analys

Utstrykningar av spermaprover förbereddes enligt beskrivningen ovan, förutom att de inte monterades med DEPEX. Efter proceduren tillsattes 0,5 % osmiumtetroxid i 30 min, och utstrykningarna placerades 3×2 min i buffert och 1×2 min i destillerat vatten. De osmiumkontrasterade utstrykningarna studerades i ljusmikroskop, och områden av intresse för ytterligare elektronmikroskopiska analyser markerades med en diamantkniv.

De utvalda utstrykningarna dehydratiserades i graderade etanollösningar och bäddades in i Epon (Bie & Berntsen). Eponblock som placerades ovanpå de tidigare markerade intresseområdena förvarades vid 60 °C i 24 timmar och bröts sedan av glasutstrykningarna. Halvtunna (3 μm) sektioner skars ut och placerades på glasobjektsglas. Efter ljusmikroskopiska analyser bäddades utvalda sektioner in i Epon igen, och ultratunna sektioner gjordes och kontrafärgades med blycitrat innan de undersöktes i ett JEOL 100S elektronmikroskop.

Statistiska metoder

Multipla regressionsanalyser tillämpades på data för att upptäcka de enskilda parametrarnas inverkan på utfallet. Spearmans rangkorrelationskoefficienter beräknades för flera korrelationer. För jämförelse av grupper utfördes Wilcoxon rangsummetestet för skillnad i medianer.

Resultat

I tabell I presenteras zink-, magnesium- och kalciuminnehållet tillsammans med den relativa andelen av katjonerna i seminalplasma. Jämförelse av medianer för dessa parametrar i de två grupperna S-TTP jämfört med L-TTP med hjälp av t-test med två stickprov visade inte på några statistiskt signifikanta skillnader för någon av dessa parametrar. En stark positiv interkorrelation hittades mellan zink, magnesium och kalcium (Spearmans rangkorrelationskoefficienter var 0,79-0,86, P < 0,01) (figur 1).

Ingen av katjonerna var nära korrelerad med någon av de konventionella spermaparametrarna. När man utförde multipel regressionsanalys på alla data var det endast zinkhalten som kom ut med ett P-värde under 0,05 för följande CASA-parametrar: VSL 0,04 och LIN 0,008. Att föra in antingen magnesium eller kalcium i modellen förbättrade inte värdena.

Semensproverna delades in i två lika stora grupper enligt katjonstatus för varje katjon. Följande delningspunkter (medianer för alla 50 prover) identifierades: zink 112 mg/l, magnesium 98 mg/l och kalcium 476 mg/l. Ett antal statistiskt signifikanta skillnader mellan de två grupperna upptäcktes (tabell II). P-värdena för zinkgrupperna visade på de största skillnaderna, kalciumgrupperna hade medelstora skillnader och magnesiumgrupperna uppvisade endast små skillnader (utom för LIN).

För den relativa proportionen mellan katjonerna (tabell III) var delningspunkterna: zink: magnesium 1,26 och zink: kalcium 0,22. Proverna med ett förhållande zink:kalcium över 0,22 uppvisade statistiskt signifikant lägre värden för CASA-parametrarna VSL, LIN och STR jämfört med proverna med ett förhållande under 0,22. Korrelationen zink:magnesium är 0,86 (Spearmans rangkorrelationskoefficient) och korrelationen zink:kalcium är 0,79. Zinkinnehållet verkar vara närmare förknippat med magnesiuminnehållet än kalciuminnehållet, vilket skulle kunna förklara skillnaden mellan grupperna.

När man utvärderade zinkjoninnehållet i AMG-preparat upptäcktes en skillnad på ljusmikroskopisk nivå i prover med låg total zinkhalt jämfört med prover med hög total zinkhalt. Figur 2 visar skillnader i AMG-färgning i ett prov med 299 mg/l och ett prov med 53 mg/l seminalzink. Färgningen runt akrosomet, svansen och i spermaplasman visade sig vara sparsam i proverna med låg totalzink. Det var inte möjligt att bekräfta dessa resultat på elektronmikroskopisk nivå (figur 3A), och i synnerhet sågs ingen skillnad i den intracellulära färgningen av spermatozoerna. Figurerna 3B och 4 visar zinkjonernas lokalisering i spermatozoernas svans. Det finns i hela svansen koncentrerat i de flagellära accessoriska fibrerna och i membranet. I den seminala plasman hittades mikrometerstora kroppar som var rika på zinkjoninnehåll (figur 5).

Diskussion

Detta är såvitt vi vet den första studien som utvärderar effekten av seminalt zink, magnesium och kalcium på TTP- och CASA-parametrar hos friska människor. Man fann ett samband mellan höga zinkkoncentrationer och låg linjäritet i spermiernas rörelser, vilket uttrycktes genom en minskning av VAP, VSL, STR och LIN. Magnesium- och kalciumkoncentrationer var nära korrelerade med zinkkoncentrationen, men var inte lika starkt förknippade med CASA-parametrarna. Den rörliga koncentrationen visade sig inte påverkas av den totala koncentrationen av zink, magnesium och kalcium. Man fann dock skillnader mellan hög respektive låg zinkhalt och vissa CASA-parametrar (tabell II). När man jämförde de 25 spermaproverna med lägst total zinkhalt (median 72 mg/l) med de 25 proverna med högst total zinkhalt i seminalen (median 187 mg/l) visade Wilcoxon rangsummetestet en statistiskt signifikant skillnad i medianer för VSL (P = 0,004) samt LIN (P = 0,001). För VAP var skillnaden också signifikant (P = 0,02). Ingen skillnad hittades för VCL. Eftersom det inte fanns några skillnader i procent motilitet eller motilitetskoncentration i proverna med låg och hög zinkhalt verkar det därför som om en zinkrik miljö får spermiecellerna att röra sig mer slumpmässigt och mindre framåtriktat. Det verkar inte minska antalet rörliga spermier.

VSL uttrycker hur långt rakt fram spermiecellen rör sig under en viss tid, och är troligen, ur klinisk synvinkel, den viktigaste CASA-parametern. En studie av Moore och Akhondi (1996) om befruktningskapaciteten hos epididymala spermatozoer från råttor visade att en nedgång i VSL var starkt negativt korrelerad med resultatet av befruktning in vitro.

Under årens lopp har det funnits en stor debatt om den roll som zink i seminalplasman spelar för spermiernas funktioner. Spermahuvudet ackumulerar en mångdubbelt högre koncentration än spermaplasma, och zink är viktigt för kromatinets stabilitet och för kromatinets förmåga att dekondenseras vid lämplig tidpunkt (Kvist, 1982; Kvist och Björndahl, 1985; Kvist et al., 1987, 1988), och det har föreslagits att zink skulle ha en fysiologisk roll som bevarare av en inneboende mekanism för huvudets svansavskiljning (Bjorndahl och Kvist, 1982). Det har dock funnits motstridiga rapporter om effekten av seminalt zink på spermiernas motilitet, och de flesta studier har handlat om kvantitativa bedömningar. I en studie av Lewis-Jones et al. (1996) mättes zink- och fruktoskoncentrationer i spermaplasman hos 1178 patienter som remitterats för fertilitetsbehandling, men för zink hittades ingen statistiskt signifikant korrelation till motilitet. Abou-Shakra et al. (1989) har mätt flera spårämnen i spermaplasma med hjälp av ICP-MS, men upptäckte ingen korrelation mellan zinkkoncentration i sperma och vare sig spermatäthet eller motilitet hos normospermatiska, oligospermatiska eller azoospermatiska män. Koncentrationerna av zink i deras undersökning liknade de nivåer som presenteras i denna undersökning. Danscher et al. (1978) har rapporterat att höga zinkkoncentrationer är förknippade med nedsatt spermiemotilitet, medan andra har rapporterat att en hög zinkhalt i spermaplasma är förknippad med en hög grad av spermiecellsmotilitet (Stankovic och Mikac-Devic, 1976; Caldamone et al., 1979).

I den här studien har vi behandlat både kvantitativa bedömningar av total zink och kvalitativ bestämning av zinkjonernas lokalisering i spermiecellen och i sädesvätskan. Även om inga skillnader i zinkjoninnehållet i spermierna upptäcktes på ultrastrukturell nivå (figur 2A) bland proverna med hög eller låg total zinkhalt, kan de egenskaper som sågs på ljusmikroskopisk nivå (figur 1) återspegla ett förhållande mellan total mängd zink och fria zinkjoner i seminalplasma. I nyligen genomförda studier har Lewis-Jones et al. (1996) och Carpino et al. (1998) dragit slutsatsen att den totala zinkmängden i seminalen är en otillförlitlig markör för spermatogen aktivitet och föreslår att biotillgängliga zinkjoner som är bundna till vesikulära proteiner med hög molekylvikt är ett bättre index. Den AMG-metod som presenteras här visar på kelaterbart zink, dvs. zinkjoner i plasma eller zink som är löst bundet till makromolekyler. Zink som är fast bundet till proteiner kommer inte att upptäckas av AMG och kan inte chelateras. Vi håller med de nämnda studierna om att det är det biotillgängliga (alltså chelaterbara) zinket som utövar funktioner på spermier, inklusive motilitet. Den här studien visar att koncentrationerna av total zink och chelaterbar zink är relaterade till varandra. Ytterligare studier är nödvändiga, och datoriserad bildanalys t.ex. av AMG-preparat skulle kunna vara ett viktigt verktyg.

I motsats till effekterna av zink verkade hög magnesiumkoncentration i sig inte ha någon hämmande effekt på spermiernas motilitet. En negativ effekt på LIN hittades, men den var inte tillräckligt stor för att ha någon inverkan på de andra CASA-parametrarna. Det har rapporterats att mänsklig spermaplasma innehåller sekretoriska granuler och vesiklar av prostataursprung som kan ha en reglerande effekt på spermiernas rörlighet genom att modulera koncentrationen av viktiga katjoner i deras miljö (Stegmayr et al., 1982). Membranen i dessa organeller innehåller Mg2+- och Ca2+-beroende ATPas som inhiberas kompetitivt av Zn2+ (Ronquist et al., 1978a,b). Hög positiv korrelation mellan zink och magnesium i spermaplasma har tidigare rapporterats (Papadimas et al., 1983; Umeyama et al., 1986), och i denna studie hittades liknande starka interkorrelationer mellan alla tre katjoner (r = 0,79-0,86, P < 0,01).

Kalcium är viktigt för spermiernas fysiologi inklusive motilitet (Morton et al, 1974; Lindemann et al., 1987), metabolism (Peterson och Freund, 1976), akrosomreaktion och befruktning (Yanagimachi och Usui, 1974; Yanagimachi, 1981). Den roll som seminalt kalcium spelar för spermiernas rörlighet är dock inte helt klarlagd. Thomas och Meizel (1988) fann att chelatering av extracellulära kalciumjoner med EGTA hämmade akrosomreaktionen, men att den samtidigt inte hade någon effekt på motiliteten. Tillsats av den jonofor ionomycin, som inducerar akrosomreaktion och inducerar tvåvärt katjoner, hade inte heller någon effekt på rörligheten, men ökade antalet akrosomreagerande spermieceller avsevärt. Magnus et al. (1990) fann inget samband mellan koncentrationer av joniserat kalcium och andelen spermatozoer som uppvisar progressiv rörelse. Arver och Sjöberg (1982) har rapporterat att lågt joniserat kalcium är förknippat med fler och bättre progressivt rörliga spermatozoer. Prien et al. (1990) jämförde spermiernas motilitet, hastighet och progressiva rörelse med totalt och joniserat kalcium hos patienter med normal (>60%) och nedsatt (<60%) spermiernas motilitet. Ingen skillnad i totalt kalcium hittades, men en statistiskt signifikant minskning av joniserat kalcium i spermier hittades hos de män med minskad motilitet. I den här studien mättes totalkalcium, men den kalciumbindande kapaciteten hos den seminala plasman är inte känd. Liksom för kalcium upptäcktes ingen inverkan på den motila koncentrationen, och korrelationerna till CASA-parametrarna var svagare än för zink (tabell II). Både VSL och LIN uppvisade omvänt signifikanta korrelationer till den totala kalciumkoncentrationen (P = 0,02 för båda), medan VCL var opåverkad. Men genom att lägga till zinkkoncentrationen i en multipel regressionsanalys försvann effekterna av den totala kalciumkoncentrationen på motiliteten. Detta stämmer överens med den tidigare nämnda studien av Prien et al. (1990). I denna studie uppvisade prover med en låg zink:kalciumkvot statistiskt signifikant bättre CASA-värden (VSL, LIN och STR) jämfört med prover med en hög kvot. Detta beror främst på skillnader i zinkkoncentrationen.

Precisionen av zink-, magnesium- och kalciumbestämningarna i denna studie var relativt dålig, med variationskoefficienter på 18, 32 respektive 17 %. Orsaken är troligen provernas inhomogenitet, vilket i kombination med de små provvolymerna (20 μl) kan ha försämrat precisionen. Trots den stora oprecisionen var den variation som genererades vid zink- och magnesiumbestämningar liten jämfört med det stora koncentrationsintervallet i proverna.

Det har tidigare visats att kelering av zinkjoner påverkar spermiernas motilitet hos människa (Danscher och Rebbe, 1974), råtta och hund (Saito et al., 1967; Stoltenberg et al., 1997). Studier med intra- och extracellulär kelering av zinkjoner genomförs för närvarande, och detta kan avslöja betydelsen av zinkjonernas placering i sädesvätskan och i spermiecellen.