Abstract

Se evaluaron los efectos del zinc, el magnesio y el calcio en el plasma seminal sobre el tiempo de embarazo (TTP) en parejas sanas, sobre los parámetros convencionales del semen y sobre los parámetros del análisis de semen asistido por ordenador (CASA). La localización de los iones de zinc quelables en el plasma seminal y en los espermatozoides se evaluó mediante autometalografía (AMG). Se evaluaron las diferencias en la localización del zinc quelable en muestras con alto y bajo zinc total. Las muestras de semen de 25 parejas con TTP corto y 25 parejas con TTP largo fueron sometidas a análisis de semen convencional, CASA, mediciones de zinc y magnesio por espectrometría de masas con plasma acoplado inductivamente, y de calcio por espectrometría de absorción atómica de llama. Los cationes estaban fuertemente interrelacionados, pero no se encontró ninguna correlación con el TTP o los parámetros convencionales del semen. Las muestras de semen con altas concentraciones de zinc mostraron una motilidad estadísticamente significativa más pobre, evaluada por los parámetros CASA de velocidad de línea recta y linealidad, que las muestras con bajo contenido de zinc. La concentración de calcio también mostró diferencias estadísticamente significativas para los mismos parámetros, pero el efecto se eliminó introduciendo la concentración de zinc en un modelo de regresión múltiple. Las muestras de semen con alto contenido de zinc total mostraron una mayor tinción del plasma seminal en el AMG. Se sugiere que las altas concentraciones de zinc seminal tienen un efecto supresor sobre la motilidad progresiva de los espermatozoides (`calidad de movimiento’), pero no sobre el porcentaje de espermatozoides móviles (`cantidad de movimiento’).

Introducción

El contenido total de zinc en el semen de los mamíferos es elevado, y se ha descubierto que el zinc es fundamental para la espermatogénesis. La deficiencia de zinc se asocia con el hipogonadismo y el desarrollo insuficiente de los caracteres sexuales secundarios en los seres humanos (Prasad, 1991), y puede causar la atrofia de los túbulos seminíferos en la rata y, por lo tanto, el fracaso de la espermatogénesis (Millar et al., 1958; Underwood, 1977; Endre et al., 1990). Se ha informado que las altas concentraciones de zinc deprimen la captación de oxígeno en la célula espermática (Huacuja et al., 1973; Foresta et al., 1990), y la reacción acrosomal inducida por la albúmina (Foresta et al., 1990). La fijación/desprendimiento de la cabeza-cola y la condensación/descondensación de la cromatina nuclear también están influenciadas por el zinc seminal (Kvist, 1980; Bjorndahl y Kvist, 1982). Ha habido informes contradictorios sobre el efecto del zinc seminal en la motilidad de los espermatozoides (Stankovic y Mikac-Devic, 1976; Danscher et al., 1978; Caldamone et al., 1979; Lewis-Jones et al., 1996). Se ha demostrado que la quelación de los iones de zinc afecta a la motilidad de los espermatozoides (Saito et al., 1967; Danscher y Rebbe, 1974), y se ha sugerido que el zinc biodisponible unido a las proteínas vesiculares de alto peso molecular, más que el zinc seminal total, debería ser una medida del efecto del zinc en la función de los espermatozoides (Bjorndahl et al., 1991; Carpino et al., 1998).

Este estudio se centra principalmente en el zinc. Se evaluó la asociación del zinc seminal, y hasta cierto punto del magnesio y el calcio, con el tiempo de embarazo (TTP) en parejas sanas. Además, se evaluó la correlación entre estos cationes divalentes con los parámetros convencionales del semen y los parámetros del análisis de semen asistido por ordenador (CASA).

La autometalografía (AMGZn) es un método histoquímico para la detección de iones de zinc y de iones de zinc poco ligados (zinc quelable) en los tejidos. Se investigaron las diferencias en la localización de los iones de zinc a nivel de microscopía óptica y electrónica en los espermatozoides y el plasma seminal de hombres con un alto nivel de zinc total y un bajo nivel de zinc total.

Materiales y métodos

Población de estudio

Se reclutaron 430 parejas entre 52 255 miembros de cuatro sindicatos. Se obtuvieron muestras de semen de las 430 parejas, se evaluó la motilidad manualmente y mediante CASA (véase más adelante), y las muestras se almacenaron congeladas (-20°C) hasta su posterior análisis. Las parejas sin experiencia reproductiva anterior se inscribieron cuando suspendieron la anticoncepción y fueron seguidas durante un mínimo de seis ciclos menstruales completos o hasta que se reconoció el embarazo . De las 430 parejas, se seleccionaron para el presente estudio 50 parejas que se quedaron embarazadas: las 25 parejas con el TTP más corto (TTP-S, mediana de 1 mes, rango de 1 a 2 meses), y las 25 parejas con el TTP más largo (TTP-L, mediana de 10 meses, rango de 7 a 28 meses). Las muestras de semen de estas 50 parejas se sometieron a los análisis mencionados a continuación.

Características convencionales del semen

Las muestras de semen se obtuvieron mediante masturbación en frascos de poliestireno estériles de 50 ml después de los 3 días de abstinencia recomendados. Tras la licuación, las muestras se analizaron a temperatura ambiente según los criterios de la Organización Mundial de la Salud (1992).

El volumen se midió en un tubo de vidrio Falcon graduado de 10 ml (precisión de 0,1 ml). Las evaluaciones manuales de la motilidad de los espermatozoides se realizaron en una cámara de recuento Makler (Sefi Medical Instruments, Haifa, Israel). Cada espermatozoide encontrado se calificó de la siguiente manera: a: motilidad progresiva rápida, b: motilidad progresiva lenta o perezosa, c: motilidad no progresiva, d: inmotilidad. Se realizaron al menos 2×100 puntuaciones. Si la diferencia entre dos recuentos consecutivos superaba el 10%, se realizaban dos nuevos recuentos. El porcentaje de espermatozoides móviles se definió como grupos “a + b + c”. La concentración se midió en una cámara de recuento de Makler, y la morfología se clasificó según los criterios “estrictos” de Tygerberg descritos por Kruger et al. (1986) en frotis secados al aire y fijados en etanol y éter, teñidos con la técnica de Papanicolaou (Organización Mundial de la Salud, 1992). La puntuación de la morfología fue realizada por un solo técnico de laboratorio capacitado. La viabilidad de los espermatozoides se determinó en frotis teñidos con eosina-negrosina.

Análisis de semen asistido por ordenador

El material para el CASA se obtuvo como sigue: Se transfirieron 4,5 μl de espermatozoides frescos y bien mezclados con una pipeta a una cámara de recuento Makler con una profundidad de 10 μm. La muestra se colocó en un microscopio de contraste de fase Olympus BH-2 (Olympus Denmark A/S, Glostrup, Dinamarca) con una placa calefactora (37°C) a un aumento de ×200. Una cámara de vídeo Sony DXC-107 (Sony Corp., Tokio, Japón) transfería las imágenes a un monitor de vídeo en color Sony PVM-1440QM (Sony Corp., Tokio, Japón). Las grabaciones de las imágenes se realizaron en una grabadora de vídeo JVC HR-D560EG/E (JVC Victor Company of Japan, Tokio, Japón). Las grabaciones se analizaron posteriormente en un Hobson Sperm Tracker (Hobson Tracking Systems Ltd, Sheffield, Reino Unido) con una frecuencia de adquisición de 25 Hz, un tiempo de seguimiento de 2 s (total de 50 fotogramas), un campo de visión de 300×300 μm (que permite detectar todos los valores de velocidad en línea recta de hasta 150 μm/s). Se analizaron 100 espermatozoides por muestra.

De los análisis se derivaron los siguientes parámetros: velocidad curvilínea (VCL), velocidad en línea recta (VSL), linealidad (LIN), velocidad media de la trayectoria (VAP) y amplitud del desplazamiento lateral de la cabeza (ALH).

Determinación de zinc, magnesio y calcio en el semen

Se midieron el zinc, el magnesio y el calcio seminales en las 50 muestras. Las concentraciones de zinc y magnesio en el semen se determinaron mediante espectrometría de masas con plasma acoplado inductivamente (ICP-MS). El instrumento fue un PQ2+ de Fisons Elemental (Winsford, Cheshire, Reino Unido). Una alícuota de 20 μl se diluyó 100 veces con una solución que contenía 5 g/l de amoníaco al 25% (ARISTAR; Merck, Poole, Reino Unido), 0,5 g/l de EDTA (Janssen Chimica, Geel, Bélgica) y 0,5 g/l de Triton X-100 (Sigma, St Louis, MO, EE.UU.) en agua Millipore de 18 MW. Como estándar interno, se añadió escandio (AccuStandard, New Haven, CT, EE.UU.) hasta una concentración final de 100 μg/l. Todas las muestras se prepararon por duplicado. La calibración se llevó a cabo utilizando muestras en blanco, a las que se había añadido zinc y magnesio (AccuStandard) a concentraciones finales de 1, 2 y 3 mg/l, correspondientes a concentraciones de 100, 200 y 300 mg/l en las muestras de semen originales. Este análisis se llevó a cabo en modo de salto de pico con mediciones en 24Mg, 66Zn y 45Sc.

La determinación del calcio se realizó en las mismas preparaciones mediante espectrometría de absorción atómica de llama (FAAS). El instrumento fue un Perkin-Elmer 306 (Norwalk, CT, USA). La calibración se realizó para concentraciones correspondientes a 100, 200 y 400 mg/l en las muestras originales de semen. Las muestras con altas concentraciones de calcio se diluyeron tres veces más para que quedaran dentro de la curva de calibración.

Los límites de detección, calculados como tres veces la desviación estándar para 10 muestras en blanco preparadas en la misma ocasión que las muestras, fueron de 1 mg/l para el zinc, 3 mg/l para el magnesio y 2 mg/l para el calcio (expresados como concentraciones en las muestras de semen sin diluir). Los coeficientes globales de variación en las determinaciones, calculados a partir de los resultados de los análisis por duplicado, fueron del 18% para el zinc, del 32% para el magnesio y del 17% para el calcio.

También se realizaron preparaciones para la determinación del zinc por espectrometría de absorción atómica de llama (FAAS) en diez de las muestras. El análisis de regresión lineal de los resultados de ICP-MS frente a los de FAAS dio una pendiente de 0,79 (intervalo de confianza del 95%: 0,58-1,00), un intercepto de 13 μg/l y un r2 de 0,90. Los resultados algo más elevados de los análisis por ICP-MS no fueron, por tanto, estadísticamente significativos.

Desarrollo autometalográfico (AMG) de frotis de semen para su análisis al microscopio óptico

Cinco muestras con alto (242-308 mg/l) y 5 con bajo (38-57 mg/l) contenido de zinc determinado por ICP-MS se incubaron en sulfuro de sodio al 0,5% (Bie & Berntsen) durante 30 minutos para crear redes de sulfuro de zinc. Se hicieron frotis de la solución de eyaculado/sulfuro en portaobjetos de vidrio enjuagados por Farmer. Los frotis se secaron al aire, se fijaron en glutaraldehído al 3% (Bie & Berntsen) durante 30 minutos y se colocaron en tampón fosfato 0,1 M durante 3×2 minutos y una vez en agua destilada durante 2 minutos.

Los frotis se revelaron con AMG para amplificar con plata las redes de sulfuro de zinc. El revelado consistió en 60 ml de solución de goma arábiga filtrada (1 kg disuelto en 2 l de agua destilada; Bidinger A/S, Aarhus, Dinamarca), 10 ml de tampón de citrato de sodio y 0,85 g de hidroquinona (Merck, Darmstadt, Alemania) disueltos en 15 ml de agua destilada caliente. Inmediatamente antes de su uso, se añadieron 0,11 g de lactato de plata (Fluka, Buchs, Suiza) en 15 ml de agua destilada y se mezcló bien la solución.

Los frascos enjuagados que contenían los frotis de semen se colocaron en un baño de agua a 26°C y se transfirieron a una caja hermética. El revelador AMG recién preparado se vertió en los frascos y los frotis se revelaron durante 30 minutos en la caja oscura.

Después del revelado, los frotis se enjuagaron en agua desionizada corriente durante 10 minutos, se colocaron en tiosulfato de sodio al 5% durante 5 minutos, se lavaron con agua desionizada corriente durante 2 minutos, se posfijaron con etanol al 70% durante 30 minutos y, finalmente, se lavaron con agua desionizada corriente durante 2 minutos. La contratinción se realizó con una solución acuosa de azul de toluidina al 0,1%, pH 4,0 (1 g de azul de toluidina en 1000 ml de tampón: 614,5 ml de ácido cítrico monohidratado 0,1 M y 385,5 ml de fosfato ácido de sodio dihidratado 0,2 M; Merck, Darmstadt, Alemania). Los frotis se colocaron durante 2 × 2 min en agua destilada, 3 × 3 min en etanol al 99%, 3×3 min en xilol y, finalmente, se montaron con DEPEX (Merck, Darmstadt, Alemania).

Preparación de frotis de semen para el análisis microscópico electrónico

Los frotis de las muestras de semen se prepararon como se ha descrito anteriormente, excepto que no se montaron con DEPEX. Tras el procedimiento, se añadió tetróxido de osmio al 0,5% durante 30 minutos, y los frotis se colocaron durante 3×2 minutos en tampón y 1×2 minutos en agua destilada. Los frotis contrastados con osmio se estudiaron en el microscopio óptico, y las áreas de interés para posteriores análisis microscópicos electrónicos se marcaron con un cuchillo de diamante.

Los frotis seleccionados se deshidrataron en soluciones de etanol graduadas y se incrustaron en Epon (Bie & Berntsen). Los bloques de Epon colocados sobre las áreas de interés previamente marcadas se mantuvieron a 60°C durante 24 h y luego se rompieron los frotis de vidrio. Se cortaron secciones semifinas (3 μm) y se colocaron en portaobjetos de vidrio. Tras los análisis de microscopía óptica, las secciones seleccionadas se volvieron a incrustar en Epon, y se realizaron secciones ultrafinas y se contrateñaron con citrato de plomo antes de examinarlas en un microscopio electrónico JEOL 100S.

Métodos estadísticos

Se aplicaron análisis de regresión múltiple a los datos para detectar el impacto de los parámetros individuales en el resultado. Se calcularon los coeficientes de correlación de rango de Spearman para varias correlaciones. Para la comparación de grupos se realizó la prueba de suma de rangos de Wilcoxon para la diferencia de medianas.

Resultados

En la Tabla I se presentan los contenidos de zinc, magnesio y calcio junto con la proporción relativa de los cationes en el plasma seminal. La comparación de las medianas de estos parámetros en los dos grupos S-TTP frente a L-TTP mediante pruebas t de dos muestras no reveló diferencias estadísticamente significativas para ninguno de estos parámetros. Se encontró una fuerte intercorrelación positiva entre el zinc, el magnesio y el calcio (los coeficientes de correlación de rango de Spearman fueron de 0,79-0,86, P < 0,01) (Figura 1).

Ningún catión estaba estrechamente correlacionado con ninguno de los parámetros convencionales del semen. Al realizar un análisis de regresión múltiple sobre todos los datos, sólo el contenido de zinc resultó con un valor P inferior a 0,05 para los siguientes parámetros CASA: VSL 0,04, y LIN 0,008. La introducción del magnesio o del calcio en el modelo no mejoró los valores.

Las muestras de semen se dividieron en dos grupos de igual tamaño según el estado catiónico de cada catión. Se identificaron los siguientes puntos de separación (medianas de las 50 muestras): zinc 112 mg/l, magnesio 98 mg/l y calcio 476 mg/l. Se detectaron varias diferencias estadísticamente significativas entre los dos grupos (Tabla II). Los valores P para los grupos de zinc indicaron las mayores diferencias, los grupos de calcio tuvieron diferencias intermedias, y los grupos de magnesio mostraron sólo una escasa diferencia (excepto para LIN).

Para la proporción relativa entre los cationes (Tabla III) los puntos de división fueron: zinc:magnesio 1,26, y zinc: calcio 0,22. Las muestras con una proporción zinc:calcio superior a 0,22 mostraron valores inferiores estadísticamente significativos para los parámetros CASA VSL, LIN y STR en comparación con las muestras con una proporción inferior a 0,22. La correlación zinc:magnesio es de 0,86 (coeficiente de correlación de rango de Spearman), y para el zinc:calcio es de 0,79. El contenido de zinc parece estar más relacionado con el de magnesio que con el de calcio, lo que podría explicar la diferencia entre los grupos.

Al evaluar el contenido de iones de zinc en las preparaciones de AMG, se detectó una diferencia a nivel del microscopio óptico en las muestras con poco zinc total en comparación con las muestras con mucho zinc total. La figura 2 muestra las diferencias en la tinción de AMG en una muestra con 299 mg/l y una muestra con 53 mg/l de zinc seminal. La tinción alrededor del acrosoma, la cola y en el plasma seminal resultó ser escasa en las muestras con bajo zinc total. No fue posible confirmar estos hallazgos a nivel de microscopio electrónico (Figura 3A), y en particular no se observó ninguna diferencia en la tinción intracelular de los espermatozoides. Las figuras 3B y 4 muestran la localización de iones de zinc en la cola de los espermatozoides. Se encuentra en toda la cola concentrado en las fibras accesorias flagelares y en la membrana. En el plasma seminal se encontraron cuerpos de tamaño micrométrico ricos en contenido de iones de zinc (Figura 5).

Discusión

Este es, según nuestro conocimiento, el primer estudio que evalúa el impacto del zinc, el magnesio y el calcio seminales en los parámetros TTP y CASA en seres humanos sanos. Se encontró una asociación entre las concentraciones elevadas de zinc y la baja linealidad de los movimientos de los espermatozoides, expresada por una disminución de VAP, VSL, STR y LIN. Las concentraciones de magnesio y calcio estaban estrechamente correlacionadas con la concentración de zinc, pero no estaban tan fuertemente asociadas con los parámetros CASA. Se comprobó que la concentración móvil no se veía afectada por la concentración total de zinc, magnesio y calcio. Sin embargo, se encontraron diferencias entre el alto y el bajo contenido de zinc y algunos parámetros CASA (Tabla II). Al comparar las 25 muestras de semen con el zinc total más bajo (mediana de 72 mg/l) con las 25 muestras con el zinc seminal total más alto (mediana de 187 mg/l), la prueba de suma de rangos de Wilcoxon reveló una diferencia estadísticamente significativa en las medianas para VSL (P = 0,004), así como para LIN (P = 0,001). En el caso de la VAP, la diferencia también fue significativa (P = 0,02). No se encontraron diferencias para VCL. Como no hubo diferencias en el porcentaje de motilidad ni en la concentración de motilidad en las muestras con bajo y alto contenido de zinc, parece que un entorno rico en zinc hace que los espermatozoides se muevan de forma más aleatoria y menos hacia delante. No parece reducir el número de espermatozoides móviles.

La VSL expresa la distancia en línea recta que se desplaza el espermatozoide en un tiempo determinado, y es muy probable que, desde un punto de vista clínico, sea el parámetro CASA más importante. Un estudio de Moore y Akhondi (1996) sobre la capacidad fecundante de espermatozoides epididimales de rata demostró que una disminución de la VSL está altamente correlacionada de forma negativa con el resultado de la fecundación in vitro.

A lo largo de los años se ha debatido mucho sobre el papel del zinc del plasma seminal en las funciones del esperma. La cabeza del espermatozoide acumula una concentración mucho mayor que la del plasma seminal, y el zinc es esencial para la estabilidad de la cromatina y la capacidad de ésta para descondensarse en el momento adecuado (Kvist, 1982; Kvist y Bjorndahl, 1985; Kvist et al., 1987, 1988), y se ha sugerido un papel fisiológico del zinc como preservador de un mecanismo inherente para el desprendimiento de la cabeza y la cola (Bjorndahl y Kvist, 1982). Sin embargo, ha habido informes contradictorios sobre el efecto del zinc seminal en la motilidad de los espermatozoides, y la mayoría de los estudios han tratado de evaluaciones cuantitativas. En un estudio realizado por Lewis-Jones et al. (1996), se midieron las concentraciones de zinc y fructosa en el plasma seminal de 1178 pacientes remitidos para un tratamiento de fertilidad, pero no se encontró una correlación estadísticamente significativa entre el zinc y la motilidad. Abou-Shakra et al. (1989) midieron varios oligoelementos en el plasma seminal mediante ICP-MS, pero no detectaron ninguna correlación de la concentración de zinc seminal con la densidad o la motilidad de los espermatozoides en varones normospérmicos, oligospérmicos o azoospérmicos. Las concentraciones de zinc en su estudio fueron similares a los niveles presentados en este estudio. Danscher et al. (1978) han informado que las concentraciones elevadas de zinc se asocian con una motilidad deprimida de los espermatozoides, mientras que otros han informado que el contenido elevado de zinc en el plasma seminal se asocia con un alto grado de motilidad de los espermatozoides (Stankovic y Mikac-Devic, 1976; Caldamone et al., 1979).

En este estudio hemos tratado tanto las evaluaciones cuantitativas del zinc total como la determinación cualitativa de la localización de iones de zinc en la célula espermática y el líquido seminal. Aunque no se detectaron diferencias en el contenido de iones de zinc de los espermatozoides a nivel ultraestructural (Figura 2A) entre las muestras con alto o bajo nivel de zinc total, las características observadas a nivel del microscopio óptico (Figura 1) podrían reflejar una relación entre la cantidad total de zinc y los iones de zinc libres en el plasma seminal. En estudios recientes, Lewis-Jones et al. (1996) y Carpino et al. (1998) han llegado a la conclusión de que el zinc seminal total es un marcador poco fiable de la actividad espermatogénica, y sugieren que los iones de zinc biodisponibles unidos a proteínas vesiculares de alto peso molecular son un mejor índice. El método AMG aquí presentado demuestra el zinc quelable, es decir, los iones de zinc en el plasma o el zinc débilmente unido a macromoléculas. El zinc unido firmemente a las proteínas no será detectado por el AMG y no podrá ser quelado. Estamos de acuerdo con los estudios mencionados en que es el zinc biodisponible (por tanto, quelable) el que ejerce funciones en los espermatozoides, incluida la motilidad. Este estudio indica que las concentraciones de zinc total y de zinc quelable están relacionadas. Son necesarios más estudios, y el análisis de imágenes computarizado, por ejemplo, de las preparaciones de AMG, podría ser una herramienta importante.

En contraste con los efectos del zinc, la alta concentración de magnesio en sí misma no pareció tener ningún efecto inhibidor sobre la motilidad de los espermatozoides. Se encontró un efecto negativo en el LIN, pero no fue lo suficientemente grande como para tener algún impacto en los otros parámetros del CASA. Se ha informado de que el plasma seminal humano contiene gránulos y vesículas secretoras de origen prostático que podrían tener un efecto regulador sobre la motilidad de los espermatozoides al modular la concentración de cationes esenciales en su entorno (Stegmayr et al., 1982). Las membranas de estos orgánulos contienen ATPasas dependientes de Mg2+ y Ca2+ inhibidas competitivamente por el Zn2+ (Ronquist et al., 1978a,b). Se ha informado previamente de una alta correlación positiva entre el zinc y el magnesio en el plasma seminal (Papadimas et al., 1983; Umeyama et al., 1986), y en este estudio se encontraron fuertes intercorrelaciones similares entre los tres cationes (r = 0,79-0,86, P < 0,01).

El calcio es importante para la fisiología de los espermatozoides, incluida la motilidad (Morton et al., 1974; Lindemann et al., 1987), el metabolismo (Peterson y Freund, 1976), la reacción del acrosoma y la fertilización (Yanagimachi y Usui, 1974; Yanagimachi, 1981). Sin embargo, el papel del calcio seminal en la motilidad de los espermatozoides no se conoce del todo. Thomas y Meizel (1988) encontraron que la quelación de los iones de calcio extracelular con EGTA inhibe la reacción acrosómica, pero al mismo tiempo no tiene ningún efecto sobre la motilidad. La adición del ionóforo de catión divalente que induce la reacción acrosómica tampoco tuvo efecto sobre la motilidad, pero aumentó significativamente el número de espermatozoides que reaccionan al acrosoma. Magnus et al. (1990) no encontraron ninguna asociación entre las concentraciones de calcio ionizado y la proporción de espermatozoides que mostraban movimiento progresivo. Arver y Sjöberg (1982) informaron que el calcio ionizado bajo se asocia con más y mejores espermatozoides móviles progresivos. Prien et al. (1990) compararon la motilidad, la velocidad y el movimiento progresivo de los espermatozoides con el calcio total e ionizado en pacientes con motilidad espermática normal (>60%) y disminuida (<60%). No se encontraron diferencias en el calcio total, pero sí una disminución estadísticamente significativa del calcio ionizado seminal en aquellos hombres con motilidad disminuida. En este estudio se midió el calcio total, pero se desconoce la capacidad de fijación del calcio en el plasma seminal. En cuanto al calcio, no se detectó ninguna repercusión en la concentración de motilidad, y las correlaciones con los parámetros de la CASA fueron más débiles que las del zinc (Tabla II). Tanto el VSL como el LIN mostraron correlaciones inversamente significativas con la concentración total de calcio (P = 0,02 para ambos), mientras que el VCL no se vio afectado. Sin embargo, al añadir la concentración de zinc en un análisis de regresión múltiple se eliminaron los efectos de la concentración total de calcio sobre la motilidad. Esto concuerda con el estudio anteriormente mencionado de Prien et al. (1990). En este estudio, las muestras con una relación zinc:calcio baja mostraron valores CASA (VSL, LIN y STR) mejores y estadísticamente significativos en comparación con las que tenían una relación alta. Esto se debe principalmente a las diferencias en la concentración de zinc.

La precisión de las determinaciones de zinc, magnesio y calcio en este estudio fue relativamente pobre, con coeficientes de variación del 18, 32 y 17%, respectivamente. La razón es probablemente la falta de homogeneidad de las muestras, que en combinación con los pequeños volúmenes de muestra (20 μl) puede haber perjudicado la precisión. A pesar de la gran imprecisión, la variación generada en las determinaciones de zinc y magnesio fue menor en comparación con el gran rango de concentración en las muestras.

Previamente se ha demostrado que la quelación de iones de zinc afecta a la motilidad de los espermatozoides en el hombre (Danscher y Rebbe, 1974), la rata y el perro (Saito et al., 1967; Stoltenberg et al., 1997). Actualmente se están realizando estudios con quelación intra y extracelular de iones de zinc, lo que podría revelar la importancia de la localización de los iones de zinc en el líquido seminal y en la célula espermática.

Los autores desean dar las gracias a la Sra. H.Brandstrup, la Sra. D.Jensen, la Sra. K.Lunding, la Sra. K.Wiedemann, la Sra. Anna Akantis y el Sr. A.Meier por su hábil asistencia técnica. El Grupo Danés de Estudio de la Fecundidad apoyó este estudio, que forma parte de un estudio de seguimiento en colaboración sobre los determinantes ambientales y biológicos de la fertilidad. El proyecto está coordinado por el Instituto Steno de Salud Pública de la Universidad de Aarhus y se realiza en colaboración con el Departamento de Crecimiento y Reproducción del Hospital Universitario Nacional de Copenhague. El estudio se ha financiado principalmente con una subvención de la Fundación de Investigación de la Universidad de Aarhus (J 1994-7430-1). También recibieron apoyo adicional el Consejo Danés de Investigación Médica (J 12-2042-1), la Fundación Danesa del Seguro de Salud (J 11/243-91, J 11/236-93), Fonden til Lægevidenskabens Fremme (A.P.Møller) y la Fundación Ciconia.