1.4.3.2 Komáři
Komáři jsou přenašeči závažných lidských onemocnění, jako je malárie, horečka dengue a žlutá zimnice, a navzdory úsilí o jejich kontrolu zůstávají vážným problémem. Očekává se, že identifikace nových genů komárů zapojených do čichu, krevní výživy, trávení, rozmnožování, imunity atd. poskytne základy pro vývoj nových metod kontroly populací komárů a nemocí přenášených komáry (Chen et al.,
Nedávné informace o sekvenci genomu tří hlavních komářích přenašečů, Anopheles gambiae, Aedes aegypti a Culex pipiens quinquefasciatus (http://www.vectorbase.org/), byly použity pro srovnávací genomiku a studie transkripčního profilování, které umožňují identifikaci velkých souborů nových komářích genů. RNAi se rychle stala nástrojem volby pro charakterizaci funkce genů v různých oblastech biologie komárů a interakcí mezi komáry a patogeny (např. Fragkoudis et al., 2009). To vedlo k publikování poměrně velkého množství funkčních RNAi testů u této skupiny organismů, včetně příslušníků aedinů (A. aegypti, Armigeres subalbtus a C. pipiens) a anofelinů (A. gambiae a Anopheles stephensi). Většina těchto studií se však zaměřila pouze na dva druhy: hlavního přenašeče horečky dengue a žluté zimnice, A. aegypti, a afrického přenašeče malárie, A. gambiae (tabulka 1.1).
V těchto studiích typická experimentální strategie zahrnovala mikroinjekci dsRNA do hrudníku dospělých komárů s následným krmením, napadením patogeny, odoranty, insekticidy nebo stresovými podmínkami a následným vyšetřením komárů za účelem analýzy fenotypového účinku umlčení cílového genu na studovaný fyziologický proces, včetně čichu, krmení, trávení a metabolismu, stresu, detoxikace, tvorby kutikuly, reprodukce, imunity a regulace diapauzy. V následujícím textu uvádíme některé reprezentativní studie RNAi u komárů.
Olfakce zprostředkovává širokou škálu chování dospělých i larválních komárů, včetně krmení, preference hostitele, vyhledávání/výběru partnera a míst pro rozmnožování vajíček. Olfakce zahrnuje vnímání chemických podnětů poskytovaných molekulami pachových látek a vývoj specifických reakcí na tyto podněty. Odoranty jsou zachycovány proteiny vázajícími odoranty (OBP), které je přenášejí k odorantovým receptorům (OR) na dendritických membránách čichových neuronů. Nedávné cílení RNAi na geny OBP i OR poskytlo cenné informace o jejich funkci v mechanismu a specifičnosti čichu (Biessmann et al., 2010; Liu et al., 2010; Pelletier et al., 2010), což otevírá možnost modifikovat vnímání čichu, a tím i řadu chování, které by mohlo vést k prevenci komářího kousání a páření.
V mírném podnebí přezimují dospělé samičky komárů v diapauze, období dormance, které je charakterizováno absencí chování při vyhledávání hostitele, hromaděním obrovských tukových zásob a zastavením vývoje vaječníků. Manipulace s regulací tohoto období dormance by mohla vést například k vyvolání dormantního stavu komárů, kteří nehledají hostitele. Příkladem toho je několik studií týmu Dr. Denlingera. Zejména nedávno použili RNAi ke zkoumání mechanismu diapauzy u C. pipiens, aby prokázali účast signální dráhy inzulín/FOXO v regulaci diapauzy (Sim a Denlinger, 2008, 2009a). Podařilo se jim také prokázat zapojení některých syntetáz mastných kyselin do akumulace tukových zásob u přezimujících samic (Sim a Denlinger, 2009b) a roli ribozomálních proteinů S3 a S2 ve vývoji folikulů u nediapauzujících samic (Kim a Denlinger, 2010; Kim et al., 2010).
Vitellogeneze a reprodukce byly u komárů také charakterizovány pomocí RNAi. Podobně jako u klíšťat vyžadují anautogenní komáři k zahájení reprodukčního cyklu zahrnujícího produkci vajíček příjem krve obratlovců-hostitelů. Aminokyseliny (AA) získané z krevní moučky využívá tukové tělo komára k syntéze prekurzorů žloutkových bílkovin, především vitellogeninu (Vg), v procesu označovaném jako vitellogeneze. Vg se pak uvolňuje do hemolymfy a je vychytáván vaječníky a ukládán do vyvíjejících se oocytů prostřednictvím specifického VgR.
Expresi genu Vg u komára A. aegypti intenzivně studoval tým Dr. Raikhela v dlouhé řadě elegantních experimentů, v nichž použil RNAi jako nástroj reverzní funkční genomiky. Tento tým prokázal, že transkripce genu Vg je přísně regulována kombinovanými vstupy několika molekul, včetně kaskády steroidního hormonu 20-hydroxyekdysonu (20E) a nutriční signalizace AA/Target-of-Rapamycin (TOR). Tato serin/treoninová kináza je zodpovědná za přenos signálu AA a aktivuje fosforylaci S6 kinázy, která je nezbytná pro aktivaci translačních dějů (Park et al., 2006; Roy a Raikhel, 2011). Kromě toho stejný tým pomocí injekce specifického antagomiru vytvořil RNAi zprostředkovanou depleci miRNAi miR-27 s cílem prokázat funkci miR-27 jako pozitivního regulátoru jak při trávení krve, tak při vývoji vajíček. Ve skutečnosti je miR-27 jako taková regulována cestami 20E a AA/TOR (Bryant et al., 2010).
Vrozený imunitní systém komářích přenašečů zahrnuje tři funkční kategorie genů zapojených do rozpoznávání patogenů, signální dráhy zprostředkovávající zesílení, modulaci a přenos signálu a efektorové mechanismy zprostředkovávající odstranění patogenu z hostitele (Baton et al., 2008). Samotná RNAi je u komárů hlavním antivirovým imunitním mechanismem. V protivirové imunitě založené na RNA je virová dsRNA rozpoznána a zpracována na siRNA komářím Dicerem. Poté tyto siRNA odvozené od viru řídí specifickou protivirovou imunitu prostřednictvím RNAi a souvisejících efektorových mechanismů umlčování RNA (Ding, 2010). Četné práce informují o využití RNAi k charakterizaci funkce imunitních genů komárů. Studie obecných imunitních mechanismů a efektorů se zaměřují na receptory rozpoznávání vzorů, molekuly antibakteriálních a antifungálních signálních drah a proteiny zapojené do dalších buněčných efektorových mechanismů (přehled v Dong et al., 2006; Moita et al., 2005; Shin et al., 2003, 2006; Wang et al., 2006).
RNAi byla také použita při charakterizaci rozhraní komár-patogen, mnoho výzkumů se zabývá molekulami souvisejícími s imunitou komárů. Molekulární interakce na rozhraní komár-patogen zajišťují přežití a vývoj patogenu i vektoru. Proto je pochopení molekulárních interakcí mezi patogeny a jejich komářími přenašeči zásadní pro vývoj nových kontrolních opatření. V posledním desetiletí bylo vyvinuto intenzivní výzkumné úsilí zaměřené na identifikaci a funkční charakterizaci genů komárů, které se podílejí na imunitních reakcích vyvolaných patogeny, s využitím různých přístupů včetně srovnávací genomiky, transkripčního profilování a funkční analýzy založené na RNAi (Baton et al., 2008). Toto úsilí bylo zaměřeno především na dvě asociace komár-patogen, A. gambiae-Plasmodium sp. a A. aegypti-dengue virus 2 (DENV-2). Vrozené imunitní reakce komárů na arbovirovou infekci podrobně rozebrali Fragkoudis et al. (2009) a reakce na malarické parazity nedávno rozebrali Brown a Catteruccia (2006) a Baton et al. (2008), včetně přístupů založených na RNAi.
Většina těchto studií založených na RNAi byla zaměřena spíše na geny z obranných mechanismů komárů než na geny potřebné pro vývoj patogenů v komářím přenašeči. Pokud jde o komáří antimalarické geny podrobené knock-downu pomocí RNAi, většina z nich jsou geny podílející se na zabíjení ookinet a melanizaci během průniku do středního střeva (přehled v Brown a Catteruccia, 2006; Baton a kol., 2008). Pokud jde o protivirové geny komárů podrobené knock-down, některé z nich jsou složkami signálních drah, zatímco jiné tvoří součást protivirové obrany založené na RNAi (přehled v Fragkoudis et al., 2009).
Mezi nejnovějšími pracemi Guo et al. (2010) představují užitečný přístup k identifikaci nových proteinů A. aegypti interagujících s DENV-2. V této práci se objevují i výsledky výzkumu, který byl proveden v roce 2010. Tito autoři vytvořili první návrh sítě proteinových interakcí komárů pomocí výpočetního přístupu a identifikovali 714 domnělých proteinů asociovaných s DENV A. aegypti, které se seskupují do čtyř hlavních funkčních kategorií (replikace/transkripce/translace, imunita, transport a metabolismus). Deset z těchto domnělých proteinů asociovaných s DENV bylo náhodně vybráno k ověření pomocí umlčení genů zprostředkovaného RNAi a u pěti z nich došlo k významnému snížení titru viru dengue ve střevech komárů.
Souhrnně tyto výsledky podporují představu, že RNAi by mohla být účinným nástrojem pro vysokokapacitní charakterizaci imunitního systému hmyzích přenašečů chorob, a přispět tak k identifikaci a charakterizaci potenciálních cílů komárů pro vývoj nových metod kontroly komářích populací, parazitů uvnitř komárů a chorob přenášených komáry.
Po objevu, že RNAi je jednou z hlavních obranných drah komárů proti arbovirům, bylo zjištěno, že potlačení této dráhy zvyšuje virovou zátěž u infikovaných komárů (Sanchez-Vargas et al., 2009). Cirimotich et al. (2009) použili virus Sindbis upravený tak, aby exprimoval protein, který se váže na dsRNA a pravděpodobně ji chrání před zpracováním v dráze RNAi, čímž působí jako supresor RNAi. Tento upravený virus produkuje v infikovaných komárech mnohem více virových částic než obvykle a je smrtelný pro řadu druhů komárů (A. aegypti, Aedes albopictus, C. trithaeniorhynchus). Tento přístup je příkladem nového vývoje založeného na genetice, potenciálně užitečného ve strategiích “potlačení populace” pro kontrolu komárů (Alphey, 2009).
Byl vyvinut i opačný cíl, tj. umělé posílení antivirové imunity komárů na bázi RNAi za účelem získání komárů odolných vůči virům. Antivirová RNAi byla použita k získání odolnosti vůči DENV u transgenních komárů A. aegypti expresí vlásenkové RNA odpovídající fragmentu viru (Franz et al., 2009). Pomocí tkáňově a časově specifických promotorů lze expresi vlásenkové RNA omezit na střední část střeva – první infikované buňky – a pouze po krevní moučce, čímž se minimalizují potenciální problémy pro fitness komárů plynoucí z konstitutivní exprese dlouhé vlásenkové RNA. Diskusi o výhodách a problémech používání tohoto druhu transgenních rezistentních kmenů komárů ve strategiích “nahrazení populace” pro kontrolu komárů lze nalézt v Alphey (2009).
.