1.4.3.2 Țânțari
Tânțarii sunt vectori ai unor boli umane grave, cum ar fi malaria, febra dengue și febra galbenă și, în ciuda eforturilor de a-i controla, ei rămân o problemă gravă. Se așteaptă ca identificarea unor gene noi ale țânțarilor implicate în olfacție, hrănirea cu sânge, digestie, reproducere, imunitate etc., să ofere bazele pentru dezvoltarea unor metode noi de control al populațiilor de țânțari și al bolilor transmise de țânțari (Chen et al., 2008).
Informațiile recente privind secvența genomului pentru trei vectori majori de țânțari, Anopheles gambiae, Aedes aegypti și Culex pipiens quinquefasciatus (http://www.vectorbase.org/), au fost utilizate pentru studii de genomică comparativă și de profilare transcripțională care permit identificarea unor rețele mari de gene noi ale țânțarilor. ARNi a devenit rapid instrumentul preferat pentru caracterizarea funcției genelor în diverse domenii ale biologiei țânțarilor și ale interacțiunilor dintre țânțari și agenți patogeni (de exemplu, Fragkoudis et al., 2009). Acest lucru a dus la publicarea unui număr destul de mare de teste RNAi funcționale în acest grup de organisme, inclusiv membri ai aedinilor (A. aegypti, Armigeres subalbtus și C. pipiens) și ai anofelinelor (A. gambiae și Anopheles stephensi). Cu toate acestea, cele mai multe dintre aceste studii s-au concentrat asupra a doar două specii: principalul vector al febrei dengue și al febrei galbene, A. aegypti, și vectorul african al malariei, A. gambiae (tabelul 1.1).
În aceste studii, strategia experimentală tipică a implicat microinjectarea de ARNdb în toracele țânțarilor adulți, urmată de hrănire, provocarea cu agenți patogeni, odoranți, insecticide sau condiții de stres și examinarea ulterioară a țânțarilor pentru a analiza efectul fenotipic al reducerii la tăcere a genei vizate asupra procesului fiziologic studiat, inclusiv olfacția, hrănirea, digestia și metabolismul, stresul, detoxifierea, formarea cuticulei, reproducerea, imunitatea și reglarea diapauzei. În cele ce urmează, prezentăm câteva studii reprezentative privind RNAi la țânțari.
Olfacția mediază o gamă largă de comportamente ale țânțarilor adulți și larvelor, inclusiv hrănirea, preferința pentru gazdă, localizarea/selecția partenerului și a locurilor de reproducere pentru ovipoziție. Olfacția implică percepția stimulilor chimici furnizați de moleculele odorante și dezvoltarea de răspunsuri specifice la astfel de stimuli. Odoranții sunt captați de proteinele de legare a odoranților (OBP), care îi transportă la receptorii de odoranți (OR) de pe membranele dendritice ale neuronilor olfactivi. Direcționarea recentă prin ARNi atât a genelor OBP, cât și a OR a furnizat informații valoroase despre funcția lor în mecanismul și specificitatea olfactivă (Biessmann et al., 2010; Liu et al., 2010; Pelletier et al., 2010), deschizând oportunitatea de a modifica percepția olfactivă și, prin urmare, o serie de comportamente care ar putea avea ca rezultat prevenirea mușcăturii și împerecherii țânțarilor.
În climatele temperate, femelele adulte de țânțari iernează în dipaus, o perioadă de latență care se caracterizează prin absența comportamentului de căutare a gazdei, acumularea unor rezerve uriașe de grăsime și o oprire a dezvoltării ovarelor. Manipularea reglării acestui episod de repaus ar putea duce, de exemplu, la inducerea unor țânțari în repaus, care nu caută gazda. Acest lucru a fost exemplificat în mai multe studii ale echipei Dr. Denlinger. În special, aceștia au folosit recent RNAi pentru a investiga mecanismul de dipausare la C. pipiens, pentru a demonstra participarea căii de semnalizare insulină/FOXOO în reglarea dipausării (Sim și Denlinger, 2008, 2009a). Aceștia au evidențiat, de asemenea, implicarea unor sintetaze ale acizilor grași în acumularea rezervelor de grăsime la femelele care iernează (Sim și Denlinger, 2009b), precum și rolul proteinelor ribozomale S3 și S2 în dezvoltarea foliculilor la femelele care nu se află în diapoziție (Kim și Denlinger, 2010; Kim et al., 2010).
Vitellogeneza și reproducerea au fost, de asemenea, caracterizate prin RNAi la țânțari. Similar cu situația de la căpușe, țânțarii anautogeni au nevoie de ingerarea de sânge de gazdă vertebrată pentru a iniția un ciclu de reproducere care implică producerea de ouă. Aminoacizii (AA) derivați din masa de sânge sunt utilizați de corpul adipos al țânțarului pentru a sintetiza precursorii proteinei gălbenușului, în principal vitellogenina (Vg), într-un proces numit vitellogeneză. Vg este apoi eliberată în hemolimfă și preluată de ovare și depozitată în ovocitele în curs de dezvoltare prin intermediul unui VgR specific.
La țânțarul A. aegypti, expresia genei Vg a fost studiată intensiv de echipa doctorului Raikhel într-o lungă serie de experimente elegante, în care au folosit RNAi ca instrument pentru genomica funcțională inversă. Această echipă a demonstrat că transcripția genei Vg este puternic reglată de aportul combinat al mai multor molecule, inclusiv de cascada hormonului steroidic 20-hidroxiecdysone (20E) și de semnalizarea nutrițională AA/Target-of-Rapamycin (TOR). Această serină/treonină kinază este responsabilă de transpunerea semnalului AA, activând fosforilarea kinazei S6, care este necesară pentru activarea evenimentelor de translație (Park et al., 2006; Roy și Raikhel, 2011). Mai mult, prin injectarea unui antagomir specific, aceeași echipă a produs epuizarea mediată de RNAi a miRNAi miR-27 pentru a demonstra funcția miR-27 ca regulator pozitiv atât în digestia sângelui, cât și în dezvoltarea ouălor. De fapt, miR-27 în sine este reglementat de căile 20E și AA/TOR (Bryant et al., 2010).
Sistemul imunitar înnăscut al țânțarilor vectori cuprinde trei categorii funcționale de gene implicate în recunoașterea agenților patogeni, căile de semnalizare care mediază amplificarea, modularea și transducția semnalelor și mecanismele efectoare care mediază eliminarea agenților patogeni din gazdă (Baton et al., 2008). ARNi este în sine un mecanism imunitar antiviral major la țânțari. În cadrul imunității antivirale bazate pe ARN, dsARN-ul viral este recunoscut și transformat în siARN-uri de către țânțarul Dicer. După aceea, aceste siARN-uri derivate din virus ghidează imunitatea antivirală specifică prin intermediul ARNi și al mecanismelor efectoare de reducere la tăcere a ARN-ului aferente (Ding, 2010). Numeroase lucrări raportează utilizarea RNAi pentru a caracteriza funcția genelor imunitare ale țânțarilor. Studiile privind mecanismele și efectorii imunitari generali s-au concentrat pe receptorii de recunoaștere a tiparelor, pe moleculele căilor de semnalizare antibacteriene și antifungice și pe proteinele implicate în alte mecanisme efectoare celulare (analizate în Dong et al., 2006; Moita et al., 2005; Shin et al., 2003, 2006; Wang et al., 2006).
ARNi a fost utilizat, de asemenea, în caracterizarea interfeței țânțar-patogen, multe investigații analizând moleculele țânțarilor legate de imunitate. Interacțiunile moleculare la interfața țânțar-patogen asigură supraviețuirea și dezvoltarea atât a agentului patogen, cât și a vectorului. Prin urmare, înțelegerea interacțiunilor moleculare dintre agenții patogeni și țânțarii lor vectori este fundamentală pentru dezvoltarea de noi măsuri de control. În ultimul deceniu, un efort intens de cercetare a fost depus pentru identificarea și caracterizarea funcțională a genelor de țânțari implicate în răspunsurile imune induse de agenții patogeni, utilizând o varietate de abordări, inclusiv genomica comparativă, profilarea transcripțională și analiza funcțională bazată pe RNAi (Baton et al., 2008). Aceste eforturi s-au concentrat în principal asupra a două asociații țânțar-patogen, A. gambiae-Plasmodium sp. și A. aegypti-Virusul dengue 2 (DENV-2). Răspunsurile imune înnăscute ale țânțarilor la infecția cu arbovirusuri au fost analizate în detaliu de Fragkoudis et al. (2009), iar cele la paraziții malariei au fost analizate recent de Brown și Catteruccia (2006) și Baton et al. (2008), inclusiv abordările RNAi.
Cele mai multe dintre aceste studii bazate pe RNAi au vizat genele din mecanismele de apărare imunitară ale țânțarilor, mai degrabă decât genele de care au nevoie agenții patogeni pentru a se dezvolta în țânțarul vector. În ceea ce privește genele anti-malarie ale țânțarilor supuse knock-down-ului RNAi, majoritatea sunt cele implicate în uciderea ookinetelor și melanizarea în timpul penetrării în midgut (analizate în Brown și Catteruccia, 2006; Baton et al., 2008). În ceea ce privește genele antivirale ale țânțarilor supuse knock-down, unele sunt componente ale căilor de semnalizare, în timp ce altele fac parte din apărarea antivirală bazată pe RNAi (analizate în Fragkoudis et al., 2009).
Printre cele mai recente lucrări, Guo et al. (2010) prezintă o abordare utilă pentru a identifica noi proteine A. aegypti care interacționează cu DENV-2. Acești autori au elaborat prima schiță a rețelei de interacțiune proteică a țânțarilor folosind o abordare computațională și au identificat 714 proteine putative asociate cu DENV A. aegypti care se grupează în patru categorii funcționale principale (replicare/transcriere/translație, imunitate, transport și metabolism). Zece dintre aceste proteine presupuse asociate cu DENV au fost selectate aleatoriu pentru validare prin silențierea genei mediată de RNAi, iar titlul viral al dengue în intestinele țânțarilor a fost redus semnificativ pentru cinci dintre ele.
Colectiv, aceste rezultate susțin ideea că RNAi ar putea fi un instrument puternic pentru caracterizarea cu randament ridicat a sistemului imunitar al insectelor vectoare de boli, contribuind astfel la identificarea și caracterizarea potențialelor ținte ale țânțarilor pentru dezvoltarea de noi metode de control al populațiilor de țânțari, al paraziților din interiorul țânțarilor și al bolilor transmise de țânțari.
După descoperirea faptului că ARNi este una dintre principalele căi de apărare ale țânțarilor împotriva arbovirușilor, s-a raportat că suprimarea acestei căi crește încărcătura virală la țânțarii infectați (Sanchez-Vargas et al., 2009). Cirimotich et al. (2009) au utilizat un virus Sindbis modificat pentru a exprima o proteină care se leagă de ARNdS și care, probabil, îl protejează de procesarea în calea ARNi, acționând astfel ca un supresor al ARNi. Acest virus modificat produce mult mai multe particule de virus decât în mod normal în țânțarii infectați și este letal pentru o serie de specii de țânțari (A. aegypti, Aedes albopictus, C. trithaeniorhynchus). Această abordare este un exemplu de nouă dezvoltare bazată pe genetică, potențial utilă în strategiile de “suprimare a populației” pentru controlul țânțarilor (Alphey, 2009).
S-a dezvoltat, de asemenea, obiectivul opus, și anume stimularea artificială a imunității antivirale a țânțarilor bazată pe ARNi pentru a obține țânțari rezistenți la virusuri. ARNi antiviral a fost utilizat pentru a conferi rezistență la DENV la țânțarii transgenici A. aegypti, prin exprimarea unui ARN în ac de păr care corespunde unui fragment al virusului (Franz et al., 2009). Cu ajutorul unor promotori specifici pentru țesut și timp, expresia ARN-ului în formă de ac de păr poate fi limitată la intestinul mijlociu – primele celule care sunt infectate – și numai după masa de sânge, reducând la minimum problemele potențiale pentru fitnessul țânțarilor derivate din expresia constitutivă a unui ARN în formă de ac de păr lung. O discuție privind avantajele și problemele legate de utilizarea acestui tip de tulpini de țânțari transgenici rezistenți în strategiile de “înlocuire a populației” pentru controlul țânțarilor poate fi găsită în Alphey (2009).
.