Mikroskopie je nezbytná v mnoha aspektech mykologie. Má 3 hlavní využití:

1. Detekce hub přímo v klinických vzorcích – konkrétní projevy mohou být vysoce charakteristické pro určité infekce, tj. infekce zygomycetami nebo indickým inkoustem v mozkomíšním moku. Přímá mikroskopie, pokud je pozitivní, je rychlejší než kultivace.
2. Potvrzení, že kultivace vzdušné houby, jako je Aspergillus, je příčinou infekce a není pravděpodobné, že by se jednalo o kontaminant.
3. Identifikace hub na základě morfologického vzhledu.

Následující část je poměrně technická a specifická a je napsána pro pracovníky laboratoří, kteří chtějí zlepšit míru detekce a dovednosti hlášení.

Tato tabulka uvádí hlavní typy vzorků a nálezů používaných pro přímou mikroskopii.

Vzorky	Detekovatelné houby a jejich vzhled
CSF	Houby Cryptococcus	Příprava inkoustu.
Odřezky vlasů, nehtů a kůže	Hyfy dermatofytů nebo jiných vláknitých hub Yeasts of Candida	Různé houby nelze rozlišit. Kultivace často negativní, takže mikroskopie je pouze důkazem infekce.
Sliznice z paranazálních dutin	Hyfy detekovatelné ve sliznici jsou diagnostické pro eozinofilní houbovou rinosinusitidu	Sliznice by měla být fixována a barvena jako u histopatologických řezů. Hyfy mohou být nepolapitelné.
Ušní zbytky/škrábance	Hyfy, obvykle se sporulujícími hlavičkami typickými pro Aspergillus niger.	Občas smíšené s buňkami Candida a kvasinek.
Skrápění rohovky při keratitidě	Mohou být patrné ionty nebo vláknité houby	Dobrý časný příznak mykotické keratitidy, nerozlišuje příčinný druh
Aspirace tkáně nebo biopsie	Hyfy vláknitých hub Hyfy Candida nebo jiných kvasinek. Sféry C. immitis	Některé houby velmi výrazné, včetně malých kvasinek bez hyf naznačujících C. glabrata nebo neseptovaných hyf zygomycet.
Dýchací tekutiny	Mycety bez významu Hyfy (bez kvasinek) odpovídající onemocnění Pneumocystis jirovecii	Hyfy obvykle septované a typické pro Aspergillus, ale pokud nejsou septované, zvažte zygomykózu nebo mukormykózu. Imunofluorescence lepší pro P. jirovecii
Krevní film nebo kostní dřeň	Intrabuněčné kvasinky typické pro Histoplasma nebo vzácně Penicillium	Vlastnost diseminované histoplazmózy a nachází se ve 40 %.
Peritoneální tekutina	Kvasinky nebo vzácně hyfy	Užitečné při potvrzení kandidy. peritonitida
Vaginální stěr/výtěr	Candida albicans (kvasinky a hyfy) nebo Candida glabrata	Klíčové diagnostický test
Mycetomové zrno	Může vykazovat hyfy s charakteristikami	Obvykle není definitivní s ohledem na druh

Metodika uchovávání

Nejstarší specifický preparát pro mikroskopii je koncentrovaný (10-20%) roztok hydroxidu draselného, který změkčuje keratin a umožňuje přímou vizualizaci hub a některé morfologické hodnocení. Barvení podle Grama je méně citlivé. Užitečné může být barvení Papanicolau. Cytologické preparáty mohou být obarveny sklíčky nebo barvením Gomori Methenamine Silver (GMS). Imunofluorescenční mikroskopie je nejlepší metodou k detekci pneumocyst. Fluorescenční zjasňovače (Calcofluor white, Blankophor nebo Tinopal UNPA-GX), které se vážou na chitin v buněčné stěně hub, jsou rychlým prostředkem pro skenování vzorků na houbové hyfy a zlepšují hodnocení morfologie.

Diagnostická úloha mikroskopie u specifických onemocnění

CSF a meningitida

Ve vzorcích CSF nebo jiných tekutinách či sekretech hostitele namontovaných v indickém inkoustu lze často detekovat zapouzdřené buňky Cryptococcus. Přibližně 50 % HIV negativních a více než 80 % HIV pozitivních pacientů má pozitivní vyšetření mozkomíšního moku indickým inkoustem. Zejména intaktní lymfocyty však mohou být s organismem zaměněny. U osob s AIDS jsou buňky kryptokoků v mozkomíšním moku obvykle hojné, ačkoli kapsle mohou být malé, což ztěžuje jejich rozpoznání. Přetrvávající pozitivní nálezy v mozkomíšním moku u pacientů podstupujících léčbu by měly být považovány za důkaz selhání nebo relapsu pouze tehdy, pokud jsou potvrzeny zhoršením klinického stavu pacienta nebo pozitivní kultivací.

Indický inkoustový preparát CSF zobrazující mnohočetné kvasinky s velkými kapsidami a úzkými pupeny k menším dceřiným buňkám, typické pro C. neoformans

Přenosový elektronový mikrofotografický snímek buňky C. neoformans pozorované v CSF u pacienta s AIDS s pozoruhodně malou přítomností kapsid. Tyto buňky mohou být mylně považovány za lymfocyty.

Vláknitá houba v mozkomíšním moku pacienta s meningitidou, ze které následně v kultuře vyrostla Candida albicans.

Vlasy

Vzorky z vlasové pokožky by měly obsahovat vlasové kořínky, obsah ucpaných folikulů a kožní šupiny. S výjimkou favusu distální část infikovaných vlasů zřídkakdy obsahuje nějakou houbu. Z tohoto důvodu jsou ostříhané vlasy bez kořínků pro mykologický výzkum nevhodné. Jednou z metod, která je užitečná pro odběr materiálu z vlasové pokožky, je odběr vzorků z vlasového kartáče.

Přímé mikroskopické vyšetření infikovaného materiálu by mělo odhalit artrokonidie dermatofyta nacházející se vně (ektothrix) nebo uvnitř (endothrix) postiženého vlasu. Artrokonidie mohou být buď malé (průměr 2-4 um), nebo velké (průměr až 10 um). Kožní šupiny obsahují hyfy a artrokonidie. Při infekci T. schoenleinii (favus) jsou uvnitř postižených chlupů vidět volné řetězce artrokonidií a vzduchové prostory. Scutulum (krusta) se skládá z mycelia, neutrofilů a epidermálních buněk.

Skrápění kůže ukazující vláknité hyfy s blankou.

Nehty

Kvalita odebraného vzorku je hlavním faktorem úspěchu či neúspěchu mikroskopie a kultivace. Odběr vzorku by měl být bezbolestný, kromě občasného mírného nepohodlí při odběru subunguálních vzorků. Na obrázku níže jsou znázorněna vhodná místa, ze kterých by měly být odebrány vzorky nehtů,

Odběry odebrané tupým skalpelem nebo ústřižky by měly být přepravovány ve složeném čtverečku papíru, nejlépe sepnutém sponkou, ale k dispozici jsou i komerční mykologické obaly. V laboratoři se k části vzorku přidá 20-30% roztok hydroxidu draselného, aby došlo k maceraci nehtového keratinu a vzorek mohl být vyšetřen na přítomnost houbových prvků přímou mikroskopií. Alternativně se část každého vzorku vyšetří v roztoku na rozpouštění nehtů obsahujícím fluorochrom. Příkladem reaktivního roztoku je tento. Připraví se rozpuštěním 1 g Na2S v 7,5 ml destilované vody a následným přidáním 2,5 ml ethanolu. Poté se k této směsi přidá 10 ml Blankophoru nebo 20 ml 1% vodného roztoku Tinopalu UNPA-GX (fluorescenční zjasňovač 28, F3543; Sigma).

Sliznice z paranazálních dutin

Diagnostickým znakem alergické plísňové rinosinusitidy (AFRS) je přítomnost eozinofilního hlenu obsahujícího hyfy, odebraného z nosu nebo paranazálních dutin pacienta bez známek napadení tkáně plísní. Hyfy mohou být v obsahu dutin řídké a jejich vizualizace pomocí v současnosti používaných barviv vyžaduje značnou dobu. Bez tohoto pozitivního znaku se obvykle stanovují jiné diagnózy, včetně alergické rinosinusitidy (ARS) nebo eozinofilní mucinové rinosinusitidy (EMRS). Použití mnohem citlivějších diagnostických technik, jako je barvení chitinu nebo specifické imunofluorescenční barvení proti alternáriím, však může zvýšit citlivost. Mezi podpůrné diagnostické znaky patří přítomnost Charcot-Leydenových krystalů, kostní eroze a heterogenní opacity s rozšířením dutiny na CT vyšetření.

Ušní kanál a zánět zevního ucha

Ze zvukovodu by měly být získány zbytky a sekret. Přímé mikroskopické vyšetření odhalí větvící se hyfy, pučící kvasinkové buňky nebo obojí. V případě aspergilové infekce lze někdy pozorovat typické sporulující hlavičky.

Skrápění rohovky při keratitidě

Fungální keratitida je lékařsky naléhavá a je třeba ji okamžitě rozpoznat a léčit. Pro mikrobiologickou diagnózu je nejvhodnějším vzorkem materiál z postižené části rohovky; materiál lze odebrat ve formě seškrabu z ulcerované oblasti nebo biopsie, pokud je epitel rohovky neporušený a infekce je omezena na stroma rohovky. Stěry z rohovky se získávají pomocí nástrojů, jako je platinová špachtle, Bobří nůž, Bard Parkerův nůž č. 15 nebo tupý kataraktový nůž. Tampony s bavlněnou špičkou jsou pro odstranění nekrotické rohovkové břečky méně účinné. Materiál by měl být odebírán ze spodiny a okrajů ulcerované části rohovky opakovaně. Pokud byl materiál stržen na sterilní médium, lze k odběru dalšího materiálu znovu použít stejné ostří nebo špachtli; pokud však materiál přišel do kontaktu s nesterilním mikroskopickým sklíčkem, je třeba ostří vyměnit, zatímco špachtli lze zapálit, ochladit a poté znovu použít.

Přímé mikroskopické vyšetření obarvených stěrů ze seškrábaného materiálu z rohovky je nejrychlejším způsobem stanovení předpokládané diagnózy. Viděné septované hyalinní hyfy vláknitých hub mohou představovat druhy Aspergillus, Fusarium nebo Acremonium. Mohou se objevit barevné septované hyfy feohyfomycet, jako je Curvularia. Příležitostně je příčinou keratitidy Candida spp., takže mohou být vidět kvasinky a hyfy, což svědčí pro tuto diagnózu. Přímějším prostředkem ke stanovení diagnózy může být konfokální mikroskopie.

ab
a. seškrab rohovky laktofenolovou bavlníkovou modří ukazuje oddělené hyfy s Fusarium spp. nebo Aspergillus spp. Dr. Philip Thomas, Tiruchirappalli ( a &b )
b. Další seškrab z rohovky obarvený laktofenolovou bavlníkovou modří ukazuje korálkové septované hyfy, které nejsou typické ani pro Fusarium spp. ani pro Aspergillus spp, spíše odpovídají dematiceózní (tj. hnědě zbarvené) houbě

Tkáňové a peritoneální tekutiny
Mikroskopický nález typických pučících kvasinkových buněk, pseudohyf a/nebo pravých hyf druhů Candida v řezech tkání nebo normálně sterilních tělních tekutinách svědčí pro invazivní kandidózu. Typicky C. glabrata vytváří pouze kvasinkové buňky a pouze C. albicans vytváří pravé hyfy ve tkáních

Barvení grafu centrifugované tekutiny (v tomto případě moči) obsahující C. albicans, zobrazující kvasinkové a hyfální formy, tak často pozorované v tomto typu vzorku.

Vyšetření vzorků dýchacích cest
Vyšetření sputa je u ABPA užitečné, protože často lze vidět hyfy s eozinofily a Charcotovy Leydenovy krystaly. Příležitostně lze mikroskopicky diagnostikovat neobvyklé plísňové infekce, když jsou vizualizovány sféry nebo velké kvasinky, jako je Blastomyces dermatitidis. V materiálu z výplachu bronchů při houbové tracheobronchitidě lze pozorovat Aspergillus nebo jiné vláknité hyfy, někdy s viditelnými sporulujícími hlavičkami. Mikroskopie má u invazivní plicní aspergilózy ze vzorků BAL vyšší výtěžnost než kultivace, v některých centrech v závislosti na použité metodě. Žádná studie neporovnávala metodiky mikroskopie nebo výtěžnost kultivace hub.

Slizniční zátka vyšetřená světelnou mikroskopií s KOH, ukazující síť hyalinních větvících se hyf typických pro Aspergillus, od pacienta s ABPA.

Tentýž preparát vzorku BAL ukazující hyalinní, septované hyfy odpovídající Aspergillus, barvený vlevo Blankoforem a vpravo KOH.

KOH preparát respirační tekutiny ukazující široké neseptované hyfy, typické pro Zygomycete.

Krvní film nebo kostní dřeň

Citlivost mikroskopie z krve a kostní dřeně není u většiny houbových infekcí dostatečně vysoká, aby ospravedlnila čas vyšetření vzorků, s výjimkou diseminované histoplazmózy a Penicillium marneffei, obvykle u AIDS.

Zrnka mycetomu

Diagnostika mycetomu závisí na identifikaci zrnek, která by měla být přednostně získána z neprasklé pustuly (dutiny) pomocí sterilní jehly. Střecha léze by měla být odklopena a obsah sinusu včetně případných zrn by měl být vytlačen a umístěn na podložní sklíčko. Každé zrnko by mělo být vybráno, opláchnuto v 70% alkoholu a poté před kultivací promyto ve sterilním fyziologickém roztoku. Přímé mikroskopické vyšetření zrn v 20% hydroxidu draselném potvrdí diagnózu mycetomu a také odhalí, zda je původcem houba nebo aktinomyceta. Černá zrna naznačují houbovou infekci; drobná bílá zrna často ukazují na infekci Nocardia a větší bílá zrna velikosti špendlíkové hlavičky mohou být buď houbového, nebo aktinomykózního původu. Malá červená zrnka jsou specifická pro Actinomadura pelletieri, ale žlutobílá zrnka mohou být aktinomykózního nebo plísňového původu. Aktinomykózní zrna obsahují velmi jemná vlákna (<1 um v průměru), zatímco houbová zrna obsahují masy krátkých propletených hyf (2-4 um v průměru), které jsou někdy pigmentované.

Denning DW, Evans EGV, Kibbler CC, Richardson MD, Roberts MM, Rogers TR, Warnock DW, Warren RE. Fungal nail disease: a guide to good practice (Zpráva pracovní skupiny Britské společnosti pro lékařskou mykologii). Br Med J 1995; 311: 1277-1281.

Monod M, Baudraz-Rosselet F, Ramelet AA, Frenk E. Direct mycological examination in dermatology: a comparison of different methods. Dermatologica. 1989;179(4):183-6. PMID: 2695355

Procop GW, Haddad S, Quinn J, Wilson ML, Henshaw NG, Reller LB, Artymyshyn RL, Katanik MT, Weinstein MP. Detekce Pneumocystis jiroveci v respiračních vzorcích pomocí čtyř barvicích metod. J Clin Microbiol. 2004 Jul;42(7):3333-5. PubMed PMID: 15243109; PubMed Central PMCID: PMC446244.

.