La microscopia è essenziale in molti aspetti della micologia. Ha 3 usi principali:

1. Rilevazione dei funghi direttamente nei campioni clinici – le apparenze particolari possono essere altamente caratteristiche di certe infezioni, per esempio l’infezione da zigomiceti o l’India Ink nel liquido cerebrospinale. La microscopia diretta, se positiva, è più veloce della coltura.
2. Conferma che una coltura di un fungo aereo come l’Aspergillus è la causa dell’infezione ed è improbabile che sia un contaminante.
3. Identificazione dei funghi, basata sulle apparenze morfologiche.

La sezione che segue è piuttosto tecnica e specifica e scritta per l’operatore di laboratorio che desidera migliorare i tassi di rilevamento e le capacità di segnalazione.

Questa tabella mostra i principali tipi di campioni e i risultati utilizzati per la microscopia diretta.

Campione	Funghi rilevabili e aspetto
CSF	Yeasts of Cryptococcus	India Ink preparation.
Ritagli di capelli, unghie e pelle	Fezioni di dermatofiti o altri funghi filamentosi Feasti di Candida	Funghi diversi non distinguibili. Colture spesso negative, quindi la microscopia è solo prova di infezione.
Mucosa dei seni paranasali	Le ife rilevabili nel muco sono diagnostiche di rinosinusite fungina eosinofila	Il muco dovrebbe essere fissato e colorato come per le sezioni istopatologiche. Le ife possono essere sfuggenti.
Dischi/raschi auricolari	Ife, di solito con teste sporulanti tipiche di Aspergillus niger.	Occasionalmente miste a Candida e cellule di lievito.
R raschiamento corneale per cheratite	Possono essere visti lieviti o funghi filamentosi	Segno iniziale utile di cheratite micotica, non distingue le specie causali
Aspirazione di tessuto o biopsia	Fezioni di funghi filamentosi Feasti di Candida o altri lieviti. Sferule di C. immitis	Alcuni funghi altamente distintivi tra cui piccoli lieviti senza ife suggestivi di C. glabrata, o ife non settate di uno Zigomicete.
Fluidi respiratori	Lieviti non significativi Ife (senza lieviti) coerenti con la malattia Pneumocystis jirovecii	Le ife solitamente settate e tipiche di Aspergillus, ma se non sono settate, considerare la zigomicosi o la mucormicosi. Imuunofluorescenza superiore per P. jirovecii
Film ematico o midollo osseo	Lieviti intracellulari tipici di Histoplasma o raramente Penicillium	Una caratteristica di istoplasmosi disseminata e trovata nel 40%.
Liquido peritoneale	Ieasti o raramente ife	Utile per confermare la Candida peritonite
Tampone vaginale	Candida albicans (lieviti e ife) o Candida glabrata	Chiave test diagnostico
Grano di micetoma	Può mostrare ife con caratteristiche	Di solito non definitive rispetto alla specie

Metodologia di conservazione

La più antica preparazione specifica per microscopia è una soluzione concentrata (10-20%) di idrossido di potassio, che ammorbidisce la cheratina e permette la visualizzazione diretta dei funghi e alcune valutazioni morfologiche. Le macchie di Gram sono meno sensibili. Le macchie di Papanicolau possono essere utili. I vetrini per citologia possono essere colorati con macchie di sliver o Gomori Methenamine Silver (GMS). La microscopia a immunofluorescenza è il metodo migliore per rilevare lo Pneumocystis. Gli sbiancanti fluorescenti (Calcofluor bianco, Blankophor o Tinopal UNPA-GX), che si legano alla chitina nella parete cellulare del fungo, sono un mezzo rapido per scansionare i campioni alla ricerca di ife fungine e migliorano la valutazione morfologica.

Il ruolo diagnostico della microscopia in malattie specifiche

CSF e meningite

Le cellule incapsulate di Cryptococcus possono spesso essere rilevate in campioni di CSF o altri fluidi o secrezioni dell’ospite montati in inchiostro di china. Circa il 50% dei pazienti HIV-negativi e più dell’80% dei pazienti HIV-positivi hanno un esame del CSF positivo alla china. Tuttavia, i linfociti intatti, in particolare, possono essere confusi con l’organismo. Nelle persone con AIDS, le cellule di Cryptococcus sono solitamente abbondanti nel CSF, anche se le capsule possono essere piccole, rendendo difficile il riconoscimento. Risultati CSF persistentemente positivi in pazienti in trattamento dovrebbero essere considerati prova di fallimento o ricaduta solo se sono confermati da un deterioramento delle condizioni cliniche del paziente o da colture positive.

Preparazione a inchiostro di china del CSF che mostra lieviti multipli con grandi capsule e gemme strette a cellule figlie più piccole, tipiche di C. neoformans

Micrografia elettronica a trasmissione di una cellula di C. neoformans vista nel CSF in un paziente con AIDS con una capsula notevolmente piccola presente. Queste cellule possono essere scambiate per linfociti.

Un fungo filamentoso nel CSF di un paziente con meningite che successivamente ha fatto crescere Candida albicans in coltura.

Capelli

I campioni dal cuoio capelluto dovrebbero includere le radici dei capelli, il contenuto dei follicoli tappati e le squame della pelle. Ad eccezione del favus, la porzione distale dei capelli infetti raramente contiene alcun fungo. Per questo motivo, i capelli tagliati senza radici non sono adatti all’indagine micologica. Un metodo utile per raccogliere materiale dal cuoio capelluto è il campionamento con spazzola per capelli.

L’esame microscopico diretto del materiale infetto dovrebbe rivelare artroconidi del dermatofita situati all’esterno (ectotrice) o all’interno (endotrice) del capello colpito. Gli artroconidi possono essere di piccole (2-4 um di diametro) o grandi (fino a 10 um di diametro) dimensioni. Le squame della pelle contengono ife e artroconidi. Nell’infezione da T. schoenleinii (favus), si vedono catene sciolte di artroconidi e spazi aerei all’interno dei peli colpiti. Lo scutulum (crosta) consiste di micelio, neutrofili e cellule epidermiche.

R raschiamento della pelle che mostra ife filamentose con blankophor.

Unghie

La qualità del campione prelevato è un fattore importante nel successo o meno della microscopia e della cultura. Il prelievo di un campione dovrebbe essere indolore, a parte un leggero disagio occasionale quando vengono prelevati campioni subungueali. La figura qui sotto mostra i siti appropriati da cui i campioni di unghie dovrebbero essere ottenuti,

I raschietti presi con un bisturi smussato o i ritagli dovrebbero essere trasportati in un quadrato di carta piegato, preferibilmente fissato con una graffetta, ma sono disponibili anche confezioni micologiche commerciali. In laboratorio, una soluzione di idrossido di potassio al 20-30% viene aggiunta ad una parte del campione per macerare la cheratina dell’unghia in modo che il campione possa essere esaminato per elementi fungini mediante microscopia diretta. In alternativa, una parte di ogni campione viene esaminata in una soluzione di scioglimento delle unghie contenente un fluorocromo. Un esempio di soluzione reattiva è questo. Viene preparata sciogliendo 1 g di Na2S in 7,5 ml di acqua distillata e aggiungendo successivamente 2,5 ml di etanolo. Successivamente, 10 ml di Blankophor o 20 ml di soluzione acquosa all’1% di Tinopal UNPA-GX (sbiancante fluorescente 28, F3543; Sigma) viene aggiunto a questa miscela.

Mucosa dai seni paranasali

Una caratteristica diagnostica della rinosinusite allergica fungina (AFRS) è la presenza di mucina eosinofila contenente ife, raccolta dal naso del paziente o dalle cavità dei seni paranasali senza evidenza di invasione dei tessuti da parte dei funghi. Le ife possono essere rade nel contenuto del seno e richiedono un tempo considerevole per essere visualizzate con le colorazioni attualmente utilizzate. Senza questa caratteristica positiva, di solito vengono fatte altre diagnosi, compresa la rinosinusite allergica (ARS) o la rinosinusite mucinica eosinofila (EMRS). Tuttavia, l’uso di tecniche diagnostiche molto più sensibili, come la colorazione della chitina o macchie specifiche di immunofluorescenza anti-Alternaria, può migliorare la sensibilità. Le caratteristiche diagnostiche di supporto includono la presenza di cristalli di Charcot-Leyden, l’erosione ossea e l’opacità eterogenea con espansione dei seni alla TAC.

Canale uditivo e otite esterna

I detriti e le secrezioni devono essere ottenuti dal canale uditivo. L’esame microscopico diretto rivelerà ife ramificate, cellule di lievito in boccio o entrambi. Nei casi di infezione da Aspergillus, le tipiche teste sporigene possono talvolta essere viste.

R raschiamento corneale per la cheratite

La cheratite fungina è un’emergenza medica e deve essere riconosciuta e trattata immediatamente. Per la diagnosi microbiologica, il miglior campione è il materiale dalla parte interessata della cornea; il materiale può essere raccolto sotto forma di raschiamento da un’area ulcerata o biopsia quando l’epitelio corneale è intatto e l’infezione è confinata allo stroma corneale. I raschiamenti corneali sono ottenuti utilizzando uno strumento come una spatola di platino, una lama Beaver, un coltello Bard Parker n. 15 o un coltello smussato per cataratta. I tamponi con punta di cotone sono meno efficaci per sbrigliare lo slough corneale necrotico. Il materiale dovrebbe essere raccolto ripetutamente dalla base e dai bordi della parte ulcerata della cornea. Se il materiale è stato strisciato su un mezzo sterile, la stessa lama o spatola può essere usata di nuovo per raccogliere ulteriore materiale; tuttavia, se il materiale è entrato in contatto con un vetrino da microscopio non sterile, la lama deve essere cambiata mentre la spatola può essere fiammeggiata, raffreddata e poi riutilizzata.

L’esame microscopico diretto di strisci colorati di materiale di raschiamento corneale è il mezzo più veloce per fare una diagnosi presunta. Le ife ialine settate di funghi filamentosi osservate potrebbero rappresentare specie di Aspergillus, Fusarium o Acremonium. Si possono vedere colorate ife settate di feoifomiceti come la Curvularia. Occasionalmente Candida spp. è la causa della cheratite e quindi si possono vedere lieviti e ife, suggestivi di questa diagnosi. La microscopia confocale può essere un mezzo più diretto per stabilire la diagnosi.

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a. Il raschiamento corneale con lactophenol cotton blue mostra ife separate con Fusarium spp o Aspergillus spp. Dr Philip Thomas, Tiruchirappalli ( a &b )
b. Un altro raschiamento corneale colorato con lactophenol cotton blue che mostra ife settate a perline non tipiche di Fusarium spp o Aspergillus spp, essendo più coerente con un fungo dematiceo (cioè di colore marrone)

Tessuti e fluidi peritoneali
Il rilevamento al microscopio di tipiche cellule di lievito in boccio, pseudofe, e/o vere ife di specie Candida in sezioni di tessuto o fluidi corporei normalmente sterili è indicativo di candidosi invasiva. Tipicamente, C. glabrata produce solo cellule di lievito, e solo C. albicans produce vere ife nei tessuti

Macchiagramma di un fluido centrifugato (in questo caso urina) contenente C. albicans, che mostra il lievito e le forme ifali, così spesso visti in questo tipo di campioni.

Campioni respiratori
L’esame dell’espettorato è utile nell’ABPA poiché le ife possono spesso essere viste con eosinofili e cristalli di Charcot Leyden. Occasionalmente infezioni fungine non comuni possono essere diagnosticate al microscopio quando si visualizzano sferule o grandi lieviti come Blastomyces dermatitidis. Aspergillus o altre ife filamentose possono essere visti nel materiale di lavaggio bronchiale da tracheobronchite fungina, a volte con teste sporulanti visibili. La microscopia ha una resa superiore alla coltura nell’aspergillosi polmonare invasiva da campioni BAL, in alcuni centri a seconda del metodo utilizzato. Nessuno studio ha confrontato le metodologie per la resa della microscopia o della coltura fungina.

Ponte mucoso esaminato al microscopio ottico con KOH, che mostra una rete di ife ialine ramificate tipiche dell’Aspergillus, da un paziente con ABPA.

La stessa preparazione di un campione BAL che mostra ife ialine e settate coerenti con Aspergillus, colorate con Blankophor a sinistra e KOH a destra.

Preparazione KOH di un fluido respiratorio che mostra ampie ife non settate, tipiche di uno Zygomycete.

Film di sangue o midollo osseo

La sensibilità della microscopia dal sangue e dal midollo osseo non è abbastanza alta per la maggior parte delle infezioni fungine da giustificare il tempo di esame dei campioni, con l’eccezione dell’istoplasmosi disseminata e del Penicillium marneffei, solitamente nell’AIDS.

Grano di micetoma

La diagnosi di micetoma dipende dall’identificazione dei grani che dovrebbero essere ottenuti preferibilmente da una pustola non rotta (seno) usando un ago sterile. Il tetto della lesione dovrebbe essere sollevato e il contenuto del seno, compresi i grani, spremuto e posto su un vetrino. Ogni granello dovrebbe essere prelevato, risciacquato in alcol al 70% e poi lavato in una soluzione salina sterile prima di essere messo in coltura. L’esame microscopico diretto dei grani in idrossido di potassio al 20% confermerà la diagnosi di micetoma e rivelerà anche se l’organismo causale è un fungo o un attinomicete. I grani neri suggeriscono un’infezione fungina; i minuscoli grani bianchi spesso indicano un’infezione da Nocardia e i grani bianchi più grandi della dimensione di una capocchia di spillo possono essere di origine fungina o attinomicetica. I piccoli grani rossi sono specifici di Actinomadura pelletieri, ma i grani bianco-giallastri possono essere di origine fungina o attinomicotica. I grani attinomicosi contengono filamenti molto sottili (<1 um di diametro), mentre i grani fungini contengono masse di brevi ife aggrovigliate (2-4 um di diametro) che sono talvolta pigmentate.

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