Linda Boettger1,2 y Diane P. Genereux2

1. Escuela de Medicina de la Universidad de Stanford; 2. Instituto Broad del MIT y Harvard

Para un perro de raza pura y, en ocasiones, incluso para un híbrido de primera generación, los servicios de inferencia de raza suelen limitarse a confirmar lo que el propietario del perro ya sabe. A veces se dispone de un pedigrí, que se remonta a múltiples generaciones de ancestros de raza pura y proporciona información esencialmente completa sobre la ascendencia de la mascota. En otros casos, la amplia experiencia del propietario le lleva a intuir correctamente que unas orejas tan caídas y una nariz tan afilada deben indicar una ascendencia beagle completa o casi completa. Por el contrario, cuando se aplica para investigar la ascendencia de un chucho, la inferencia basada en el ADN suele arrojar conclusiones sorprendentes.

La inferencia de la ascendencia basada en el ADN puede tener un gran valor práctico. Puede utilizarse para resolver debates familiares sobre la ascendencia de un chucho querido y puede ofrecer al menos la posibilidad de proteger la salud de una mascota. Por ejemplo, el hallazgo de que un chucho tiene ascendencia de una raza que se sabe que tiene un alto riesgo de cáncer podría recomendar la realización de exámenes más frecuentes para detectar tumores.

Sin embargo, como ocurre con cualquier método emergente, la inferencia de la ascendencia no está exenta de desafíos e incertidumbres. En este artículo, proporcionamos información de fondo que puede ser útil para aquellos que están considerando un servicio de ancestros o que se esfuerzan por interpretar resultados sorprendentes. Comenzamos hablando de los procesos biológicos que dan lugar a los fascinantes y complejos genomas de los chuchos, y a continuación ofrecemos una visión general de cómo los enfoques existentes tratan de desentrañar esta complejidad genómica para proporcionar información sobre la ascendencia de las razas. Concluimos discutiendo algunos de los retos que pueden comprometer las inferencias sobre la ascendencia, y comentamos qué tipo de información será necesaria para resolver estos retos en los próximos años.

¿Qué es un perro de raza pura? ¿Qué es un chucho?

Para llegar a una definición precisa de chucho, es útil considerar cómo surgieron los perros. Los datos disponibles insinúan que las interacciones inicialmente fortuitas con los humanos podrían explicar sus antiguos orígenes (Larson y Fuller, 2014). Supongamos, por el momento, que algunos lobos antiguos desconfiaban de los humanos y otros se sentían comparativamente cómodos. Según esta interpretación, la creciente disponibilidad de restos de comida humana a medida que las poblaciones humanas se expandían podría haber proporcionado una nueva fuente de alimento principal para los lobos más gregarios. Con el tiempo, estos animales formaron una población distinta de animales que preferían vivir cerca de los humanos, y tendían a aparearse entre ellos en lugar de con sus parientes más salvajes.

Si, como se requiere en cualquier escenario evolutivo, había una base genética para el rasgo que distinguía a estas dos poblaciones incipientes -en este caso, sería un conjunto de mutaciones que modulan la comodidad de un lobo individual cerca de los humanos-, entonces es posible que la disponibilidad de alimentos cerca de las poblaciones humanas explique el origen de los perros a partir de sus ancestros lobos salvajes. Es importante señalar que, según esta hipótesis, los perros no fueron domesticados por los humanos en sí. En su lugar, los humanos simplemente crearon un entorno que permitió la autodomesticación por parte de un subconjunto de lobos que, por casualidad, estaban genéticamente predispuestos a ser al menos un poco tolerantes con los humanos.

Figura 1. Los orígenes de las razas modernas. Aunque el momento exacto sigue siendo controvertido, en general se cree que los perros surgieron como una población distinta de los lobos ancestrales en Eurasia hace entre 10.000 y 40.000 años (Larson y Fuller, 2014). Según esta hipótesis, mientras que la mayoría de los lobos seguían desconfiando de los humanos y estaban sujetos a la selección natural en la naturaleza, unos pocos fueron capaces de tolerar la vida cerca de los humanos, y tal vez de aprovechar sus residuos alimenticios. Este subconjunto de lobos acabó dando lugar a una población genéticamente distinta de animales capaces de vivir cerca de los humanos. Las razas de perros específicas surgieron mucho más recientemente, y la mayoría de las razas se formaron hace menos de 150 años (Larson et al., 2012). Durante este proceso, los perros fueron criados en diferentes líneas mediante la selección de rasgos específicos como la lucha, el pastoreo, la caza o simplemente ser una buena compañía.

En general, se cree que las razas de perros modernas surgieron hace unos 150 años, durante la época victoriana, mucho después del establecimiento de los perros a partir de sus ancestros lobos. Esta deducción proviene de la observación de que los humanos crean parejas de perros que comparten rasgos considerados útiles para tareas específicas, dando lugar a distintos grupos de perros cada vez más enriquecidos por mutaciones genéticas que codifican características específicas (Larson et al., 2012). Como en cualquier proceso evolutivo, las mutaciones relevantes surgieron inicialmente de forma aleatoria y posteriormente fueron favorecidas por la cría selectiva. Varios grupos, entre ellos el American Kennel Club y el Kennel Club de la India, acabaron definiendo distintas razas, lo que finalmente dio lugar a la definición de perro de raza pura como aquel cuya ascendencia completa está representada por individuos incluidos en el libro genealógico (“Inherited Defects in Pedigree Dogs. Parte 2: Trastornos no relacionados con los estándares de la raza”, 2010). En el contexto de los procesos de cría selectiva que primero establecieron, y ahora mantienen, razas distintas, un chucho puede definirse como un perro cuya ascendencia se remonta a más de un linaje genéticamente distinto.

El objetivo de la inferencia de la ascendencia, por lo tanto, es utilizar la información genética de un chucho para inferir qué razas de perros estaban presentes entre sus ancestros, e inferir sus contribuciones genéticas relativas.

Recogida de ADN de un perro

El primer paso en la inferencia de la ascendencia es recoger y extraer ADN para la evaluación genética. Afortunadamente, la saliva es una gran fuente de ADN, y la mayoría de los propietarios encuentran que es bastante fácil de recoger. Con sólo unos instantes en la boca de un perro, uno de los hisopos de muestreo proporcionados por un servicio comercial de genotipado suele recubrirse de una gran cantidad de células. Estas células son en su mayoría de dos tipos: los glóbulos blancos, que están suspendidos en la saliva y contribuyen a la respuesta inmunitaria, y las células epiteliales, que recubren la boca y suelen ser reemplazadas cada 24 horas. Una vez recogidas las células, el hisopo (Fig. 2A) se envía por correo a una empresa de inferencia de ancestros. Allí se rompen las membranas celulares (Fig 2B) liberando el núcleo celular (Fig 2C), que contiene el ADN, y luego se libera el ADN del núcleo (Fig 2D). Las proteínas y otras biomoléculas pueden entonces ser lavadas, dando lugar a una muestra de ADN de alta calidad.

Figura 2. Aislamiento del ADN para la inferencia de la ascendencia. Durante unos momentos en la boca de un perro, un hisopo de saliva (A) recoge muchas células epiteliales e inmunitarias (B). A continuación, se pueden aislar los núcleos (C) de las células y luego lisarlas para liberar ADN (D), que luego puede limpiarse y utilizarse para el genotipado o la secuenciación.

Aunque este proceso de aislamiento de ADN a partir de hisopos de saliva es impresionantemente robusto y puede producir ADN de alta calidad de perros grandes, perros pequeños, adultos y cachorros por igual, no está exento de misterios. Este verano, por ejemplo, nosotros y algunos colegas recogimos muestras semanales de saliva de seis cachorros. Para nuestra sorpresa, la proporción de glóbulos blancos y epiteliales por muestra de saliva variaba mucho entre los individuos, y de una semana a otra. Y lo que es más sorprendente, una de las crías tenía sistemáticamente muchas más células por muestra que sus hermanas y hermanos. Esperamos saber en algún momento qué es lo que puede explicar esta espectacular variación. Por el momento, sin embargo, es tranquilizador que incluso las muestras de menor rendimiento suelen contener suficiente ADN para inferir la ascendencia.

Cómo hacer un chucho: Herencia e intercambio cromosómico

En los humanos y en los perros, la madre y el padre contribuyen casi por igual a los genomas de sus crías. El genoma canino se divide en 38 pares de autosomas (los humanos tienen 22 juegos), y un par de cromosomas sexuales (los humanos también tienen un par de cromosomas sexuales). Cada uno de los 38 pares de autosomas caninos está formado por un cromosoma aportado por el óvulo de mamá y otro aportado por el esperma de papá. El genoma de la mitocondria, un pequeño fragmento de ADN que contiene muchos genes implicados en el metabolismo, siempre lo aporta mamá.

Para modelar el origen genético de un chucho, consideremos primero el apareamiento de dos perros de raza pura: un labrador retriever macho y un caniche hembra. El esperma del macho y el óvulo de la hembra, cada uno con una copia de cada cromosoma, se combinan para formar una mezcla de labrador y caniche que lleva una copia de cada cromosoma aportado por cada progenitor.

Figura 3. Un óvulo de una caniche hembra es fecundado por un espermatozoide de un labrador retriever macho, formando una mezcla de labrador y caniche. Para cada par de cromosomas, la descendencia tiene una copia aportada por la madre (púrpura) y una copia aportada por el padre (rosa). N.B. Para mayor claridad, sólo se muestra uno de los 39 pares de cromosomas caninos en esta figura y en las siguientes.

En un apareamiento paralelo, una mamá beagle hembra y un pug macho se aparean, dando lugar a una mezcla pug-beagle macho.

Figura 4. Un óvulo de una beagle hembra es fecundado por un espermatozoide de un pug macho, formando una mezcla pug-beagle. Para cada par de cromosomas, la descendencia tiene una copia aportada por la madre (negro), y una copia aportada por el padre (azul).

Para entender cómo un chucho llega a contener contribuciones genéticas de varias razas diferentes, debemos continuar hacia la siguiente generación. Como antes, tanto la madre -aquí, un labradoodle- como el padre -aquí, un puggle- aportan uno de los cromosomas de cada pareja. Sin embargo, en lugar de transmitir los mismos cromosomas que ellos mismos han heredado, los padres aportan cromosomas recombinados, que son una combinación de fragmentos de sus propios padres (Figura 5). En este ejemplo, el cachorro resultante se llamaría chucho, y tiene ADN derivado de ancestros de cuatro razas diferentes.

Figura 5. Un óvulo de una hembra de caniche labrador es fecundado por un espermatozoide de un macho mezcla de pug-beagle, formando un chucho. Por cada par de cromosomas, la cría hereda una copia cromosómica de la madre (púrpura y rosa), y una copia cromosómica del padre (negro y azul). En este apareamiento, los dos padres son a su vez mestizos. Por lo tanto, cuando la mezcla de labrador y caniche produce óvulos y la mezcla de carlino y beagle produce esperma, los cromosomas resultantes contienen ADN de más de una raza.

La recombinación implica un intercambio justo de material genético entre los dos cromosomas que componen cada par. Cada evento de recombinación produce una nueva versión del cromosoma original, para la cual la cantidad global de material genético es la misma que antes, pero se reparte de forma diferente entre los dos cromosomas. Hay que tener en cuenta que la recombinación es inherente a la producción de esperma y óvulos: incluso en un beagle o un caniche de raza pura, los cromosomas de cada par intercambian trozos. Sin embargo, las consecuencias son más evidentes cuando los cromosomas que se recombinan tienen historias diferentes.

Inferir la ascendencia de un chucho por comparación con los genomas de referencia de los perros de raza pura

La inferencia de la ascendencia local funciona determinando qué raza contribuyó con mayor probabilidad a cada trozo del genoma de un chucho. Una vez que se ha hecho una inferencia para cada trozo de cromosoma, esas inferencias pueden sumarse para estimar la fracción global del genoma del chucho aportada por cada raza inferida.

Para inferir el contribuyente más probable de un trozo de cromosoma dado, por supuesto, necesitamos alguna manera de distinguir entre las contribuciones genéticas de varias razas. Afortunadamente, aunque la mayor parte del genoma es muy similar en todos los perros, cada raza contiene cambios genéticos específicos -llamados mutaciones- que son exclusivos de ella, o al menos mucho más comunes en ella que en cualquier otra raza. Algunas de estas mutaciones son directamente relevantes para las características de una raza concreta. Otras simplemente son únicas o más comunes en una raza que en otras, pero no tienen ninguna relevancia conocida para las características físicas específicas de la raza. Las mutaciones de ambos tipos son útiles para inferir la ascendencia. En las Figuras 3-6, las mutaciones específicas de las razas individuales, útiles para inferir la ascendencia de la raza, están representadas por el color del cromosoma.

Figura 6. Inferir la ascendencia de la raza comparando un genoma de chucho con un conjunto de genomas de referencia. Para inferir la ascendencia de una raza para un chucho, se recopila un conjunto de genomas de referencia de la raza (A), y luego se compara con el genoma del chucho de interés (B) para permitir la inferencia de la ascendencia para cada trozo de cromosoma, y la estimación de las contribuciones generales de la ascendencia. Se deduce que el chucho de arriba tiene aproximadamente las mismas contribuciones de los ancestros carlino, labrador, caniche y beagle, como era de esperar dado que tenía un abuelo de cada una de estas cuatro razas diferentes.

Los pasos para inferir la ascendencia de un chucho son entonces:

1. Recoger un conjunto de datos genéticos de perros de raza pura (Figura 6A)
2. Recoger datos genéticos del chucho de interés (Figura 6B)
3. Comparar el genoma del chucho con un genoma de referencia, hacer las mejores conjeturas sobre el origen de la raza para cada trozo de cromosoma, y sumar esos trozos de cromosomas para estimar la ascendencia general de la raza (Figura 6C)

Los datos de incluso una pequeña fracción del genoma de un chucho pueden ser útiles para la inferencia de la ascendencia

El genoma de un perro contiene alrededor de 2.5 mil millones de nucleótidos-los As, Ts, Cs y Gs que componen el ADN. Esto no es drásticamente diferente de los aproximadamente 3 mil millones de nucleótidos que componen el genoma humano. En un mundo ideal, por supuesto, sería económicamente viable recoger datos de la secuencia del genoma completo de cada perro. En las últimas dos décadas, nos hemos acercado a este objetivo. En 2001, cuando se publicó la primera secuencia completa del genoma humano, la secuenciación de cada uno de nuestros aproximadamente 3.000 millones de nucleótidos costaba 2.700 millones de dólares. El descenso masivo de los costes de secuenciación ha permitido llevar a cabo iniciativas a gran escala como el Proyecto 1.000 Genomas, que ha catalogado las secuencias del genoma completo de humanos de todo el mundo.

A pesar de estos descensos de precios, todavía cuesta unos 1.400 dólares secuenciar el genoma completo de un perro aquí en la Plataforma Genómica del Instituto Broad. Este precio es sin duda una gran mejora respecto a los precios anteriores, pero sigue siendo considerable. Afortunadamente, el genotipado ofrece una alternativa más barata -y todavía muy informativa-. A diferencia de la secuenciación del genoma completo, el genotipado analiza un subconjunto de nucleótidos dentro del genoma. En el caso del genoma del perro, por ejemplo, el chip más popular analiza unas 170.000 mutaciones.

Al principio, es difícil imaginar cómo los datos de sólo un 0,000068% del genoma de un chucho (170.000 de 2.500 millones) podrían proporcionar una representación adecuada del genoma en general. Parte de la respuesta está en los detalles del proceso de recombinación mencionado anteriormente. En cada generación, los trozos de cromosomas derivados de un determinado ancestro son cada vez más pequeños. A pesar de esta disminución general de la longitud, los trozos de cromosomas siguen siendo, durante muchas generaciones, grandes en relación con el genoma completo. Por lo tanto, con algunas advertencias importantes -y reconociendo que inevitablemente se producirán algunos errores-, suele ser razonable utilizar la identidad de un nucleótido en el genoma de un chucho para hacer una conjetura sobre la identidad de un nucleótido vecino (Figura 7). Este enfoque, denominado imputación, ha mejorado enormemente las oportunidades de inferir, a un coste comparativamente bajo, los componentes de la ascendencia en perros mestizos.

Figura 7. La imputación utiliza la información del genotipo de algunos nucleótidos para hacer conjeturas informadas sobre otros. Para un cromosoma formado por la recombinación de ADN de caniche (púrpura) y de labrador retriever (rosa), la identificación de la ascendencia racial de las posiciones 1 y 2, que fueron aportadas por el labrador retriever, permite adivinar correctamente el origen racial de la región circundante. Por el contrario, la posición 3 está cerca de un punto de ruptura entre trozos de cromosoma; los datos de ese sitio conducen a una conjetura correcta sobre el origen de las posiciones a la izquierda pero no a la derecha de la posición muestreada.

¿Cómo funciona un chip de genotipado?

Los chips de genotipado canino diseñados por empresas como Affymetrix e Illumina están optimizados para identificar mutaciones relevantes para la enfermedad. El resultado es que sólo el subconjunto de mutaciones con mayor probabilidad de ser clínicamente informativas se interroga para cada perro, manteniendo los costes bajos.

El ADN es una molécula de doble hebra muy pegajosa en la que cada hebra quiere unirse a la otra, la secuencia complementaria. En el ADN de toda la vida en la Tierra, la A (adenina) se empareja con la T (timina), y la C (citosina) con la G (guanina). Por tanto, la secuencia de ADN “ATCG” se pegaría a la secuencia complementaria “TAGC”. Sin embargo, incluso una diferencia de una letra (es decir, “TGGC”) puede impedir que los dos trozos de ADN se unan entre sí. Los chips de genotipado aprovechan este principio de unión selectiva para determinar qué mutaciones están presentes en un perro determinado. Las sondas de ADN están diseñadas para unirse a secciones del ADN de un perro que contienen la forma mutada y, alternativamente, la forma no mutada del ADN. Estas secuencias cortas se adhieren a la parte superior de un pequeño portaobjetos de cristal que suele denominarse “chip” o “matriz” (Figura 8).

Figura 8. Genotipado para determinar qué mutaciones tiene cada perro. Las sondas de ADN (secuencias cortas complementarias a las mutaciones de interés) están presentes en diferentes lugares de la matriz de genotipado. Aquí ilustramos la detección de una de las miles de mutaciones analizadas por el chip. Después de añadir el ADN del perro y dejar que se una al ADN del chip, se lava el ADN que no se ha unido. A continuación, se añaden moléculas fluorescentes que se unen al ADN canino restante. De este modo, las mutaciones presentes en un perro pueden identificarse visualizando qué regiones de la matriz de genotipado están brillando.

Para asegurar la unión a estas sondas cortas de genotipado, el ADN aislado de la saliva de un chucho se rompe primero en trozos diminutos. A continuación, se adhiere al ADN del perro una sustancia química que se adhiere perfectamente a las moléculas fluorescentes que serán fundamentales para interpretar los resultados. El ADN del chucho se lava sobre el chip y cada hebra se une a su secuencia de sonda complementaria. Así, trozos del ADN del chucho encuentran la sonda correspondiente en el chip de genotipado. Dos características garantizan una unión específica y, por tanto, datos fiables. En primer lugar, una sonda de genotipado no puede unirse al ADN del chucho derivado de una parte diferente del genoma. En segundo lugar, no puede unirse a la forma mutada de la secuencia a menos que el perro tenga esa mutación específica (es decir, la secuencia “A” ilustrada anteriormente). El ADN que no se ha unido se lava del portaobjetos y, por último, las moléculas fluorescentes se unen al ADN restante que se ha unido con éxito a las sondas. Dado que cada sonda se creó en un lugar específico de la matriz, podemos interpretar qué mutaciones tiene un perro observando qué pequeños puntos de la matriz brillan.

Factores que pueden socavar la inferencia de la ascendencia

A pesar de los recientes avances, hay varios problemas persistentes que pueden socavar los esfuerzos para inferir con precisión la ascendencia de la raza en perros mestizos.

Figura 9. Sólo se puede inferir un ancestro si el genoma relevante está presente en el conjunto de referencia. Para las razas que están bien representadas entre los genomas de referencia, y bien muestreadas por una matriz de genotipado (por ejemplo, el caniche, el carlino y el labrador retriever en el escenario anterior) los esfuerzos de inferencia de ancestros normalmente tendrán éxito en la identificación tanto de la presencia como del porcentaje aproximado de ADN contribuido por la ascendencia reciente de esa raza. Sin embargo, en el caso de las razas que no están bien representadas en los genomas de referencia (por ejemplo, el beagle en la situación anterior), los trozos de cromosomas suelen atribuirse erróneamente a una raza mejor representada (por ejemplo, el basset hound en la situación anterior), lo que conduce a una evaluación incorrecta de la ascendencia de un chucho.

Aunque algunos problemas pueden dar lugar a una mera subestimación del porcentaje de ascendencia del chucho que procede de una raza específica, otros problemas pueden impedir que se identifique la raza correcta en absoluto. El más importante de estos problemas es la ausencia de una verdadera raza ancestral en el conjunto de datos de referencia (Figura 9). Dado que la ascendencia de la raza se infiere comparando trozos de ADN de chuchos con perros de raza pura de razas conocidas, si una raza está ausente del conjunto de datos de referencia, esa raza simplemente no puede ser detectada, incluso si contribuyó con una fracción muy grande del ADN de un chucho. Este problema sólo se resolverá en última instancia mediante la inclusión de genomas de referencia de razas reconocidas; mientras tanto, si está interesado en saber si su perro tiene ascendencia de una raza rara específica, es importante asegurarse de que la empresa de ancestros de razas que elija sea capaz de comprobar esa raza. Para aquellos que decidan proceder a la inferencia de ascendencia aunque se sepa que la raza de interés está ausente del conjunto de referencia, es importante tener en cuenta que la ausencia de esa raza en la lista de ancestros inferidos no proporciona información sobre si el chucho carece realmente de esa ascendencia concreta.

Las mutaciones seleccionadas para el genotipado también determinan qué ascendencias de raza pueden identificarse con precisión en un perro mestizo. Las matrices de genotipado tienden a incluir más mutaciones presentes en las razas comunes. Esto significa que los trozos de cromosomas de caniches y pastores alemanes pueden ser especialmente fáciles de identificar porque muchas de las mutaciones comunes en estas razas se analizan en las matrices de genotipado. Aunque muchas mutaciones podrían ayudar a identificar trozos de ADN de razas raras como los perros cantores de Nueva Guinea o los Skye terrier, algunas de estas mutaciones podrían no estar representadas en las matrices de genotipado de uso generalizado, lo que podría dificultar la identificación de estas razas. Este problema se resolverá con el tiempo mediante la creación de conjuntos de datos de referencia de razas con datos de secuencias, lo que permitiría la interpretación de muchas más mutaciones y no estaría sesgada hacia la detección de la ascendencia de razas específicas.

La relación de un chucho con sus ancestros de raza pura también afecta a la fiabilidad de la determinación de la raza. En particular, es más fácil identificar la ascendencia de raza del ADN de un antepasado de raza pura que es un pariente cercano (como un padre) porque las mutaciones de los antepasados recientes residirán en trozos más largos de ADN con mutaciones más informativas. Por ejemplo, mientras que la primera mutación observada en el cromosoma de un chucho puede ser común tanto en los labradores como en los Golden Retriever, quizás la primera, segunda y tercera mutaciones observadas sólo se vean juntas en los Golden Retriever. El ADN aportado por los antepasados de muchas generaciones atrás existirá sólo como trozos de cromosoma cortos, con menos mutaciones que ayuden a identificar su contribución a la ascendencia del chucho, lo que hace más difícil la inferencia. Este problema puede mitigarse utilizando datos de secuenciación en lugar de genotipado, lo que permite analizar todas las mutaciones. Sin embargo, el ADN heredado de muchas generaciones atrás puede estar en trozos de cromosomas tan cortos que no contendrá trozos de cromosomas característicos de una raza específica, de modo que las contribuciones de la raza a la ascendencia de un chucho no pueden detectarse ni siquiera con datos del genoma completo (Li et al., 2014).

¿Qué es lo siguiente? ¿Debería genotipar a mi perro?

Como ocurre con cualquier tecnología nueva, la inferencia de razas es una oportunidad apasionante que introduce algunos retos sin resolver. Muchos propietarios de perros intrigados por saber más sobre los orígenes de su mascota seguramente apreciarán tener una ventana para saber qué razas contribuyeron a la genética única de su chucho. Incluso podrían ganarse el derecho a especular que la excelente resistencia de su perro a gran altura proviene de su abuelo Lhasa Apso (Li et al., 2014). Aun así, instamos a los propietarios a ser cautelosos y a recordar que una variedad de problemas puede comprometer la fiabilidad de las inferencias, a la vez que se mantienen optimistas de que la inferencia mejorará a medida que se acumulen los datos de referencia.

“Defectos heredados en perros de raza. Parte 2: Trastornos que no están relacionados con los estándares de la raza”. 2010. The Veterinary Journal 183 (1). W.B. Saunders:39-45.

Larson, Greger, y Dorian Q. Fuller. 2014. “La evolución de la domesticación de los animales”. Annual Review of Ecology, Evolution, and Systematics 45 (1):115-36.

Larson, Greger, Elinor K. Karlsson, Angela Perri, Matthew T. Webster, Simon Y. W. Ho, Joris Peters, Peter W. Stahl, et al. 2012. “Repensar la domesticación del perro integrando la genética, la arqueología y la biogeografía”. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 109 (23):8878-83.

Li, Yan, Dong-Dong Wu, Adam R. Boyko, Guo-Dong Wang, Shi-Fang Wu, David M. Irwin, y Ya-Ping Zhang. 2014. “La variación de la población reveló la adaptación a la alta altitud de los mastines tibetanos”. Molecular Biology and Evolution 31 (5):1200-1205.