Design og fremstilling af shRNA-plasmider
For at besvare spørgsmålet om, hvordan shRNA-sekvensen korrelerer med knockdown-effektiviteten, blev 27 shRNA-vektorer fra 11 forskellige gener designet og konstrueret (Tabel 1). Målsekvenser blev udvalgt i den kodende region af hvert gen og blev designet til i vid udstrækning at være i overensstemmelse med de seminale undersøgelser af sekvensfunktioner for siRNA-oligomer effektivitet . Følgelig har sekvenserne et lavt antal løb og et G/C-forhold på ca. 50 %. ShRNA’erne blev designet til at ramme steder, der er blottet for enkelt nukleotidpolymorfismer, og svarer til alle splejsningsvarianter, der er amplificeret af vores realtids-PCR-primersæt.
Da siRNA’er kan have off-target-effekter, er det vigtigt for funktionelle analyser at lave en specifik mutant med en eller flere base-mismatch inden for målgenkendelsesstedet som en kontrol . For at spare tid og omkostninger har vi udviklet en metode til at fremstille wild-type og mutant shRNA-vektorer samtidigt (detaljeret i Metoder og Figur 1). Resultater af genknockdown for fire wild-type/mutant shRNA-par er vist i figur 2. Disse resultater viser, at denne metode er nyttig med hensyn til at tilvejebringe en punktmutant shRNA-vektor, der kan tjene som en tab af funktionskontrol for nedbrydning af gener ved hjælp af shRNA’er af vildtypen. Selv om der er offentliggjort detaljerede protokoller til konstruktion af shRNA-vektorer , er dette den første protokol til samtidig fremstilling af wild-type- og mutantvektorer, og det skulle lette gennemførelsen af et stærkt kontrolleret system til shRNA.
Design til samtidig fremstilling af wild-type- og mutant shRNA-vektorer. En fremadrettet streng af wild-type hårnålen (blå) syntetiseres sammen med en omvendt streng, der indeholder en mutation på én bp inden for både sense- og antisense-kopien af målsekvensen (vist med rødt). Den dobbeltstrengede hybrid er ligeret ind i den retrovirale vektor 5′ fra en H1-promotor og transformeret i kompetente bakterier. Da replikationen er semi-konservativ, vil datterbakterierne bestå af to forskellige populationer, der enten bærer en dobbeltstrenget wild-type- eller en dobbeltstrenget mutantvektor, og de kan isoleres ved at forberede og sekventere individuelle kolonier.
Genekspressionsanalyse for wild-type og mutant shRNA-vektorer fremstillet samtidig ved hjælp af wild-type/mutant dobbeltstrengede hybrider. (A) Sekvenser af målstederne for fire wild-type- og mutant shRNA-vektorer, der blev fremstillet samtidigt som beskrevet i figur 1. (B) Realtidsanalyse af shRNA-knockdown og tab af knockdown ved mutant shRNA-vektorer fra (A). Værdierne er standardiseret til 100 % i ikke-transducerede THP1-celler. Ekspressionen i THP1-celler, der er transduceret med en tom vektor (EV), er vist som en yderligere kontrol. Værdierne repræsenterer gennemsnit +SEM for mindst tre analyser udført i duplikat.
Strategi for nøjagtig sekventering gennem hårnålsstrukturer
Verificering af sekvensen af en shRNA-hårnål er afgørende, da fejlmatchning af blot ét nukleotid inden for målsekvensen kan ophæve knockdown (Figur 2 og .) Et problem, som man ofte støder på ved fremstillingen af shRNA-vektorer, er, at mange af dem er vanskelige at sekventere på grund af hårnåles iboende sekundære struktur. En strategi, der for nylig blev foreslået for at overvinde dette problem, indebærer, at man konstruerer et restriktionssted i loop/stem-regionen af hairpin’en for fysisk at adskille de inverterede gentagelser ved fordøjelse og derefter sammensætter sekvensen ved hjælp af sense- og antisense-primere . Det ville imidlertid være en klar fordel at kunne sekventere shRNA-konstruktioner uden at ændre stamme/loop-sekvensen. For at tage fat på denne mulighed evaluerede vi modificerede sekventeringsreaktioner med henblik på at forbedre gennemlæsningen af hairpin-sekundærstrukturen i tre shRNA-hairpins. Modifikationerne omfatter tilføjelse af midler, der er kendt for at slappe af i DNA-strukturen, herunder DMSO, Betaine, PCRx Enhancer og ThermoFidelase I; og tilføjelse af stigende mængder dGTP BigDye terminator (dGTP) kemi til standard BigDye v1.1 (BD) kemi, som indeholder dITP i stedet for dGTP.
Sequenceringsresultater for hver af de tre DNA-konstruktioner er opsummeret i tabel 2. Gennemlæsning af hårnålekonstruktionen blev målt som forholdet mellem tophøjden ca. 300 baser efter hårnålekonstruktionen og signalet ca. 50 baser før hårnålekonstruktionen. Et forhold på 1 angiver intet tab af signal, og 0 angiver fuldstændigt tab af gennemlæsning. I fravær af ethvert additiv til BD-kemien forårsagede hårnålen en reduktion af forholdet mellem tophøjden for vores mindre tæt strukturerede hårnål, pHSPG-shmutTLR4, til 0,4, og et fuldstændigt tab af gennemlæsning for de to andre plasmider. Dette kan visualiseres som et abrupt stop i sekvenspeakprofilen for pHSPG-shTLR4 (figur 3A).
DNA-sekventering af pHSPG-shTLR4 ved hjælp af modificerede reaktionsbetingelser. DNA-sekventeringstoppene er vist i en visning i fuld skala, hvor basepositionerne er angivet ved talrækken i hvert panel, og Y-aksen er signalintensiteten. De viste sekventeringsreaktionsbetingelser er BigDye v1.1 (BD)-kemi (A), 0,83 M Betain + 1 ×PCRx Enhancer i BD-kemi (B), 10:1 BD:dGTP-kemi (C), 0,83 M Betain + 1 ×PCRx Enhancer i 10:1 BD:dGTP-kemi (D) og 1 × ThermoFidelase I i 10:1 BD:dGTP-kemi (E). Faldet i signalet (trin i peakhøjden) ved hårnålen er fremhævet med en pil i panelet 10:1 BD:dGTP-kemier.
Af de DNA-afslappende midler forbedrede 5 % DMSO, 0,83 M Betain og 1 × PCRx Enhancer hver især sekvensaflæsningen betydeligt for nogle konstruktioner. Tilføjelsen af 0,83 M Betain plus 1 × PCRx Enhancer til BD-kemi viste sig imidlertid at sekventere mest konsistent, med tophøjdeforhold på 0,5-0,9 (tabel 2 og figur 3B). Tilføjelsen af 10:1 BD:dGTP-kemikalier alene forbedrede også gennemlæsningen en smule, med tophøjdeforhold på 0,5-0,6 (tabel 2 og figur 3C). Det suboptimale peakhøjdeforhold for 10:1 BD:dGTP kan tilskrives et synligt trin i sekvensens peakprofil efter sekundærstrukturområdet, hvor signalet reduceres (Figur 3C, pil). Ved at øge indholdet af dGTP-kemi til 5:1 og 3:1 BD:dGTP eller ved at anvende ren dGTP-kemi øgedes peakhøjdeforholdet og trinene reduceredes en smule (0,6 til 0,8 forhold). Den blandede inkorporering af dITP og dGTP resulterede imidlertid i en værre topudvidelse, efterhånden som mængden af anvendt dGTP steg , og ren dGTP-kemi forårsagede alvorlige sekvenskompressioner (data ikke vist). De bedste samlede resultater blev observeret ved at kombinere Betaine plus PCRx og 10:1 BD:dGTP blandede kemier sammen. Denne kombination reducerede trinene med mindre topudvidelse og øgede forholdet mellem tophøjderne til 0,9-1,0 (tabel 2 og figur 3D). ThermoFidelase I, et DNA-destabiliserende enzym, der ofte anvendes til at forbedre sekventeringen af genomisk DNA , forbedrede ikke sekventeringen af nogen af de tre hårnåle i ren BD-kemi (data ikke vist) og reducerede faktisk peakhøjdeforholdet betydeligt i 10:1 BD:dGTP-kemier for alle tre shRNA-konstruktioner, hvilket forårsagede, at der igen opstod et stop ved hårnåle-strukturen (tabel 2 og figur 3E).
Sammenfattende gav kombinationen af 10:1 BD:GTP-kemier, 0,83 M Betain og 1 × PCRx Enhancer optimal sekventering, og blandede BD:dGTP-kemier, Betain, PCRx Enhancer og DMSO havde hver for sig nogle positive virkninger. ThermoFidelase I bør dog sandsynligvis undgås for shRNA-vektorer med vanskelig intrinsisk sekundærstruktur.
Korrelation mellem shRNA knockdown-effektivitet og offentliggjorte algoritmer for siRNA-design
For at bestemme, om effektiviteten af knockdown ved hjælp af shRNA-vektorer korrelerer med offentliggjorte regler for design af effektive siRNA-oligonukleotider, blev shRNA’er evalueret for deres evne til at knockdown-genekspression. ShRNA’erne blev transduceret stabilt i enten THP1- eller Jurkat-cellelinjer af mennesker som beskrevet i tabel 3, de to første kolonner. Den gennemsnitlige knockdown blev bestemt ud fra RNA indsamlet på tre eller flere forskellige dage og er anført for hvert shRNA (kolonne 3). Knockdown blev vist at være reproducerbar for cellelinjer, der blev uafhængigt transduceret og sorteret, hvilket tyder på, at knockdown er en funktion af shRNA-målsekvensen snarere end træk ved den virale transduktion . Mere end en tredjedel af de konstruerede shRNA-vektorer var ikke i stand til at undertrykke transkriptionen (<10% i kolonne 3) på trods af sammenlignelige vækstrater og langtidsudtryk af GFP-markøren på høje niveauer i disse cellelinjer. Desuden taler store variationer i knockdown-effektiviteten for flere shRNA’er fremstillet mod mange af de samme gener (dvs. CLR16.2, CLR19.3 og TLR4) imod simple biologiske årsager til forskelle i effektivitet for disse gener. Mange af de ineffektive shRNA’er har negative 5’ΔΔG-værdier og høj Reynolds-scoring, som hver især er blevet anset for at korrelere med siRNA-knockdown-effektivitet (tabel 3, kolonne 4 og 5) . Omvendt havde flere af de shRNA’er, der var i stand til at give genknockdown, enten positive 5’ΔΔG-værdier eller lave Reynolds-scoringer. Disse resultater tyder på, at 5’ΔΔG- og Reynolds-scoringsalgoritmen for siRNA måske ikke giver positive korrelative kriterier for shRNA-design.
For at afgøre, om andre offentliggjorte algoritmer til siRNA-oligonukleotiddesign kan anvendes på shRNA-vektorer, blev hvert af shRNA-målstederne evalueret af fire yderligere algoritmer, og scorer blev plottet mod den procentvise knockdown for hvert shRNA (tabel 3, kolonne 6-9 og fig. 4). For hvert algoritmeplot blev der tegnet en linje med den bedste tilpasning, og R2-værdien blev beregnet som en indikation af, om variationen i knockdown-effektiviteten kan forklares af algoritmens scoring. Resultaterne bekræfter en dårlig sammenhæng mellem shRNA-effektivitet og enten 5′ ΔΔG-betragtninger (differentiel fri energi) eller Reynolds et al.-algoritmen , og viser også en dårlig sammenhæng med Hsieh et al.-algoritmen , idet hver af dem faktisk viser en svag omvendt korrelation med dataene. Algoritmerne af Amarguizoui et al. , Ui-Tei et al. og Takasaki et al. korrelerer direkte med shRNA-effektiviteten. Ingen af algoritmescorerne forklarer imidlertid en betydelig procentdel af variationen i knockdown-effektiviteten. Blandt de testede algoritmer viser Takasaki et al.s scoringssystem den højeste association med en R2-værdi på 0,0251.
Korrelation mellem shRNA knockdown-effektivitet og scoring for seks offentliggjorte algoritmer for siRNA. Algoritmescorer for hvert shRNA-målsted fra tabel 2 er plottet op mod den observerede knockdown-effektivitet for algoritmerne Hsieh et al. (A), 5′ ΔΔG (differentiel fri energi) (B), Reynolds et al. (C), Amarzguioui et al. (D), Ui-Tei et al. (E) og Takasaki et al. (F). 5’ΔΔG-scoren er plottet på en omvendt vandret akse, da knockdown-effektiviteten forudsiges at korrelere med en negativ 5’ΔΔG-værdi. En tendenslinje er vist sammen med R2-værdien for hvert plot. Knockdown på mindre end 10 % er plottet som nul.
Da disse resultater tyder på, at en lineær sammenhæng ikke i høj grad gælder for shRNA-knockdown for nogen af de seks algoritmer, evaluerede vi hver af algoritmerne ved hjælp af ROC-kurveanalyse for at afgøre, om nogen algoritme er overlegen i forhold til de andre til at identificere effektive shRNA’er. ROC-kurven er et plot af følsomheden (den ægte positive fraktion, TPF) over for 1 minus specificiteten (den falsk positive fraktion, FPF), som genereres ved at variere beslutningstærsklen mellem den mindste og den største algoritmescore. Diagonalen i ROC-plottet repræsenterer ROC-kurven for en algoritme, der ikke er bedre til at skelne end tilfældig udvælgelse. Algoritmer, der er dårlige diskriminatorer, har ROC-kurver, der følger diagonalen og har et areal under ROC-kurven (AUC), der ikke er signifikant forskelligt fra AUC for diagonalen (0,5). Algoritmer, der er gode diskriminatorer, har ROC-kurver med stærk konveks afvigelse fra diagonalen og AUC’er, der nærmer sig 1 og er signifikant forskellige fra diagonalens AUC.
Hsieh et al.s algoritme havde en konkav ROC-kurve (fig. 5A), hvilket indikerer uacceptabel følsomhed og specificitet i forhold til at skelne effektive fra ineffektive shRNA’er. ROC-kurverne for alle andre algoritmer (fig. 5B-F) fulgte nær diagonalen i ROC-plottet og havde AUC’er, der ikke var signifikant forskellige fra AUC’en for diagonalen (fig. 5B-F). Ingen af algoritmerne viste således en statistisk signifikant evne til at skelne mellem effektive og ineffektive shRNA’er.
ROC-kurveanalyse af siRNA-scoringalgoritmer. Den ægte positive fraktion blev plottet mod den falsk positive fraktion, efterhånden som beslutningstærsklen varierede fra minimum til maksimumscorer (se materialer og metoder for nærmere oplysninger) for algoritmerne Hsieh et al. (A), 5′ ΔΔG (differentiel fri energi) (B), Reynolds et al. (C), Amarzguioui et al. (D), Ui-Tei et al. (E) og Takasaki et al. (F) ved hjælp af en effektivitetstærskel på 50 % knockdown. ROC-kurver for modificerede Amarzguioui et al. (G), Ui-Tei et al. (H) og Takasaki et al. (I) algoritmer er også vist. Et sæt på 38 offentliggjorte shRNA’er (tabel 5) blev analyseret ved hjælp af de modificerede Amarzguioui et al. (J), Ui-Tei et al. (K) og Takasaki et al. (L) algoritmer for at bekræfte nytten af de modificerede algoritmer. Arealet under kurven (AUC) og sandsynligheden (p) for, at AUC er signifikant forskellig fra 0,5, arealet under diagonalen, er angivet for hver ROC-kurve.
Algoritmen fra Takasaki et al. (Fig. 5F) viste sig at være den mest lovende som en diskriminator af effektive fra ineffektive shRNA’er. Denne algoritme led imidlertid af en forholdsvis høj falsk positiv fraktion for beslutningstærskler nær den maksimale score, hvilket fremgår af den svage, uregelmæssige afvigelse fra diagonalen nær ROC-kurvens oprindelse (fig. 5F). Dette indikerede, at algoritmen tildelte en høj score til en række ineffektive shRNA’er. En inspektion af dataene afslørede, at to af de tre ineffektive shRNA’er med høj score var rettet mod gener, hvis ekspression blev slået ned med succes af andre shRNA’er (tabel 3, asterisk). Det er således usandsynligt, at shRNA’ernes ineffektivitet er en konsekvens af et selektivt pres mod en stabil undertrykkelse af genekspression. Det er mere sandsynligt, at Takasaki et al.s algoritme ikke tager højde for et kritisk træk ved effektive shRNA’er.
Anvendelse af en algoritmemodifikation baseret på stabiliteten af de 6 centrale baser i hvert shRNA
Inspektion af de fysiske egenskaber af de ineffektive shRNA’er med høj scoring viste, at den gennemsnitlige stabilitet af duplexet dannet af de 6 centrale baser i shRNA’erne (baser 6-11 i sense-strengen hybridiseret med baser 9-14 i antisense-strengen) var større end den gennemsnitlige stabilitet af effektive shRNA’er med høj scoring (ΔG = -13.1 ± 0,1 mod henholdsvis -11,1 ± 1 kcal/mol). På baggrund af denne observation blev Takasaki et al.s algoritme ændret således, at shRNA’er med en central duplex ΔG på lig med eller mindre end -12,9 kcal/mol fik tildelt en minimumsscore (tabel 4). Denne ændring tildelte minimumsscorer til fem shRNA’er, hvoraf fire var ineffektive, hvilket øgede algoritmens specificitet uden et væsentligt tab af følsomhed. En minimumsscore, der blev tildelt ét effektivt shRNA (71 % knockdown), viser, at andre egenskaber ud over central duplexstabilitet har indflydelse på virkningen. Ikke desto mindre eliminerede tilføjelsen af denne ændring den svage uregelmæssige afvigelse af ROC-kurven fra diagonalen for høje beslutningstærskler og øgede AUC til 0,79 (fig. 5I). En lignende ændring af Amarzguioui et al.s og Ui-Tei et al.s algoritmer hævede også AUC’erne for deres ROC-kurver (fig. 5G og 5H). Med denne modifikation var AUC’erne for ROC-kurverne for alle tre modificerede algoritmer signifikant forskellige fra AUC’en for diagonalen (fig. 5G-I), hvilket indikerer en statistisk signifikant forudsigelsesevne. Forskellene mellem AUC’erne for ROC-kurverne for de modificerede algoritmer var ikke signifikante, så på statistisk grundlag var alle tre modificerede algoritmer lige anvendelige. Algoritmerne 5′ ΔΔG, Reynolds et al. og Hsieh et al. blev ikke forbedret til en statistisk signifikant forudsigelsesevne ved at anvende den centrale duplex ΔG-modifikation (data ikke vist).
For at imødegå muligheden for, at den forbedring, der opnås ved ændringen af Amarzguioui et al., Ui-Tei et al. og Takasaki et al. algoritmerne, er en konsekvens af overtilpasning af vores sæt af shRNA’er, blev et uafhængigt sæt på 38 shRNA’er, der er samlet fra tidligere publikationer (; tabel 5), underkastet en analyse. Mens ingen af ROC-kurverne for de tre umodificerede algoritmer havde en AUC, der var signifikant forskellig fra diagonalens AUC (Amarzguioui et al., p = 0,174; Ui-Tei et al. p = 0,09; Takasaki et al., p = 0,26), gav alle de modificerede algoritmer ROC-kurver med AUC’er, der var signifikant forskellige fra diagonalens AUC (p = 0,0001-0,009; fig. 5J-L). Statistisk set var alle tre modificerede algoritmer lige anvendelige, da AUC’erne for ROC-kurverne for de modificerede algoritmer alle var signifikant forskellige fra AUC’en for diagonalen, men ikke signifikant forskellige fra hinanden. Denne analyse af et uafhængigt sæt af shRNA’er tyder på, at ændringen af algoritmerne har generel gyldighed.
Da minimering af den falsk positive rate er den primære bekymring ved shRNA-design, anbefaler vi at anvende den modificerede Ui-Tei et al. algoritme, som havde den laveste høje falsk positive fraktion ved beslutningstærskler nær den maksimale score som angivet ved den stærke afvigelse fra diagonalen nær ROC-kurvens oprindelse (fig. 5H og 5K). Ved at anvende en beslutningstærskel på 3 begrænses udvælgelsen af shRNA’er til et område af ROC-kurven, hvor følsomheden var acceptabel (0,28-.33), mens specificiteten var meget god (1,0). Ved at fastsætte denne beslutningstærskel blev den falsk positive fraktion minimeret, mens 28-33 % af de effektive shRNA’er blev identificeret fra henholdsvis vores shRNA’er og det offentliggjorte sæt af shRNA’er. Hvis det skulle være nødvendigt at øge følsomheden, anbefaler vi at anvende en beslutningstærskel på 2. Denne tærskel havde en følsomhed på 0,54 – 0,55 og en specificitet på 0,88 – 0,9. Hvis beslutningstærsklen blev lempet yderligere til 0, steg følsomheden til 0,86 – 0,9, men specificiteten faldt til 0,55 – 0,54. Vi anbefaler, at man anvender den højest mulige af disse beslutningstærskler.
Men selv om denne undersøgelse er statistisk set lille, har den den fordel, at den så vidt vi ved, er det største offentliggjorte sæt af 19-mer-baserede shRNA’er til dato. I modsætning til andre shRNA-undersøgelser, der nødvendigvis er skævt fordelt på effektive shRNA’er, omfatter vores undersøgelse desuden både funktionelle og ikke-funktionelle shRNA’er. Vi har vist, at modificerede algoritmer fra Ui-Tei et al., Amarzguioui et al. og Takasaki et al. er rimelige til gode prædiktive værktøjer, der skelner mellem effektive og ineffektive shRNA’er. Der er dog stadig betydelige mangler ved de modificerede algoritmer. En direkte vurdering af algoritmemodifikationerne ved hjælp af shRNA’er, der er designet i henhold til hver original og modificeret algoritme, ville underbygge disse resultater. Disse algoritmer er beregnet til at reducere antallet af udvalgte falsk positive shRNA’er, ikke til helt at fjerne dem, og det ville således kræve et stort antal shRNA’er for at opnå en statistisk signifikant forskel i falsk positiv rate. Tilgængeligheden af større shRNA-datasæt bør støtte udviklingen af algoritmer med forbedret følsomhed og specificitet. Desuden kan flere softwareapplikationer til design af siRNA-oligonukleotider, som ikke blev taget i betragtning i denne undersøgelse, være nyttige ved design af shRNA’er . Kriterierne for udformning af funktionelle siRNA-oligonukleotider er fortsat kontroversielle, hvilket fremgår af det store antal undersøgelser, der stadig udarbejdes til siRNA-design, og da vi ikke testede disse sekvenser som siRNA’er, kan det ikke fastslås, om ændringen af disse algoritmer også gælder i forbindelse med siRNA-oligonukleotider. shRNA har et ekstra lag af kompleksitet i forhold til siRNA-oligonukleotider, da hårnålen skal behandles i cellen, før den kommer ind i RISC-komplekset. Desuden forventes det, at det selektive pres mod den stabile ekspression af shRNA’er, der er skadelige for cellevæksten, vil udgøre en yderligere begrænsning for den stabile ekspression af visse shRNA’er. På trods af disse kompleksiteter begynder vores resultater at give indsigt i evnen til at anvende siRNA-algoritmer til design af funktionelle shRNA’er.