Die Mikroskopie ist in vielen Aspekten der Mykologie unerlässlich. Sie hat 3 Hauptverwendungszwecke:

1. Der direkte Nachweis von Pilzen in klinischen Proben – die besonderen Erscheinungen können sehr charakteristisch für bestimmte Infektionen sein, z. B. Zygomyceteninfektion oder Tausendfüßler in der Zerebrospinalflüssigkeit. Die direkte Mikroskopie ist bei positivem Befund schneller als eine Kultur.
2. Bestätigung, dass eine Kultur eines über die Luft übertragenen Pilzes wie Aspergillus die Ursache der Infektion ist und es sich wahrscheinlich nicht um eine Verunreinigung handelt.
3. Identifizierung von Pilzen auf der Grundlage morphologischer Erscheinungen.

Der folgende Abschnitt ist recht technisch und spezifisch und für den Labormitarbeiter geschrieben, der die Erkennungsraten und Berichterstattungsfähigkeiten verbessern möchte.

Diese Tabelle zeigt die wichtigsten Probentypen und Befunde, die für die direkte Mikroskopie verwendet werden.

Probe	Pilze nachweisbar und Aussehen
CSF	Eier von Cryptococcus	Tintenzubereitung.
Haar-, Nagel- und Hautabschabungen	Hyphen von Dermatophyten oder anderen Fadenpilzen Eier von Candida	Diverse Pilze nicht unterscheidbar. Kulturen oft negativ, so dass die Mikroskopie nur den Beweis für eine Infektion liefert.
Schleim aus den Nasennebenhöhlen	Hyphen, die im Schleim nachweisbar sind, sind diagnostisch für eine eosinophile Pilz-Rhinosinusitis	Schleim sollte fixiert und wie bei histopathologischen Schnitten gefärbt werden. Hyphen können schwer fassbar sein.
Ohrenschutt/Kratzen	Hyphen, in der Regel mit sporulierenden Köpfen, typisch für Aspergillus niger.	Gelegentlich gemischt mit Candida- und Hefezellen.
Hornhautausschabung bei Keratitis	Eier oder fadenförmige Pilze können gesehen werden	Hilfreiches frühes Zeichen einer mykotischen Keratitis, keine Unterscheidung der verursachenden Spezies
Gewebeaspiration oder Biopsie	Hyphen von Fadenpilzen Hefen von Candida oder anderen Hefen. Kügelchen von C. immitis	Einige Pilze sind stark ausgeprägt, darunter kleine Hefen ohne Hyphen, die auf C. glabrata hindeuten, oder nicht septierte Hyphen eines Zygomyceten.
Atemwegsflüssigkeiten	Hefen ohne Bedeutung Hyphen (ohne Hefen), die auf eine Krankheit hindeuten Pneumocystis jirovecii	Hyphen gewöhnlich septiert und typisch für Aspergillus, Wenn sie jedoch nicht septiert sind, sollte eine Zygomykose oder Mukormykose in Betracht gezogen werden. Imuunofluoreszenz überlegen für P. jirovecii
Blutfilm oder Knochenmark	Intrazelluläre Hefen typisch für Histoplasma oder selten Penicillium	Ein Merkmal der disseminierten Histoplasmose und in 40% gefunden.
Peritonealflüssigkeit	Hefen oder selten Hyphen	Hilfreich beim Nachweis von Candida Peritonitis
Vaginaler Abstrich	Candida albicans (Hefen und Hyphen) oder Candida glabrata	Schlüsseldiagnose Diagnosetest
Mycetom-Korn	Kann Hyphen mit Merkmalen aufweisen	In der Regel nicht eindeutig in Bezug auf die Art

Färbemethode

Das älteste spezifische Präparat für die Mikroskopie ist eine konzentrierte (10-20%ige) Kaliumhydroxidlösung, die das Keratin aufweicht und eine direkte Visualisierung von Pilzen und eine gewisse morphologische Beurteilung ermöglicht. Gram-Färbungen sind weniger empfindlich. Papanicolau-Färbungen können nützlich sein. Zytologische Objektträger können mit Splitter- oder Gomori-Methenamin-Silber (GMS)-Färbungen angefärbt werden. Die Immunfluoreszenzmikroskopie ist die beste Methode zum Nachweis von Pneumocystis. Fluoreszierende Aufheller (Calcofluor white, Blankophor oder Tinopal UNPA-GX), die sich an das Chitin in der Pilzzellwand binden, sind ein schnelles Mittel, um Proben auf Pilzhyphen abzutasten, und verbessern die Beurteilung der Morphologie.

Die diagnostische Rolle der Mikroskopie bei bestimmten Krankheiten

Liquor und Meningitis

Eingekapselte Kryptokokken-Zellen lassen sich oft in Proben von Liquor oder anderen Wirtsflüssigkeiten oder Sekreten nachweisen, die in Tusche eingelegt sind. Etwa 50 % der HIV-negativen und mehr als 80 % der HIV-positiven Patienten weisen eine positive Tuscheuntersuchung des Liquors auf. Allerdings können vor allem intakte Lymphozyten mit dem Organismus verwechselt werden. Bei AIDS-Patienten sind Cryptococcus-Zellen in der Regel reichlich im Liquor vorhanden, obwohl die Kapseln klein sein können, was die Erkennung erschwert. Anhaltend positive Liquorbefunde bei Patienten, die sich in Behandlung befinden, sollten nur dann als Beweis für ein Versagen oder einen Rückfall angesehen werden, wenn sie durch eine Verschlechterung des klinischen Zustands des Patienten oder durch positive Kulturen bestätigt werden.

Tintenpräparat aus Liquor, das mehrere Hefen mit großen Kapseln und schmalen Knospen zu kleineren Tochterzellen zeigt, die typisch für C. neoformans sind

Transmissionselektronenmikroskopische Aufnahme einer C. neoformans-Zelle im Liquor eines AIDS-Patienten, die bemerkenswert wenig Kapseln aufweist. Diese Zellen können fälschlicherweise für Lymphozyten gehalten werden.

Ein Fadenpilz im Liquor eines Patienten mit Meningitis, der anschließend in Kultur mit Candida albicans wuchs.

Haar

Proben von der Kopfhaut sollten Haarwurzeln, den Inhalt verstopfter Follikel und Hautschuppen umfassen. Mit Ausnahme von Favus enthält der distale Teil von infiziertem Haar selten Pilze. Aus diesem Grund sind abgeschnittene Haare ohne Wurzeln für die mykologische Untersuchung ungeeignet. Eine nützliche Methode zur Gewinnung von Material von der Kopfhaut ist die Entnahme von Haarbürstenproben.

Bei der direkten mikroskopischen Untersuchung von infiziertem Material sollten Arthrokonidien des Dermatophyten außerhalb (Ektothrix) oder innerhalb (Endothrix) des befallenen Haares gefunden werden. Die Arthrokonidien können entweder klein (2-4 um Durchmesser) oder groß (bis zu 10 um Durchmesser) sein. Die Hautschuppen enthalten Hyphen und Arthrokonidien. Bei einer Infektion mit T. schoenleinii (Favus) sind lose Ketten von Arthrokonidien und Lufträume in den betroffenen Haaren zu sehen. Das Scutulum (Kruste) besteht aus Myzel, neutrophilen Granulozyten und epidermalen Zellen.

Hautausschabung mit filamentösen Hyphen und Blankophor.

Nägel

Die Qualität der entnommenen Probe ist ein wichtiger Faktor für den Erfolg oder Misserfolg der Mikroskopie und Kultur. Die Entnahme einer Probe sollte schmerzfrei sein, abgesehen von gelegentlichem leichtem Unbehagen bei der Entnahme von subungualen Proben. Die nachstehende Abbildung zeigt die geeigneten Stellen, an denen Nagelproben entnommen werden sollten.

Abschabungen, die mit einem stumpfen Skalpell entnommen werden, oder Ausschnitte sollten in einem gefalteten Papierquadrat transportiert werden, das vorzugsweise mit einer Büroklammer befestigt wird; es sind aber auch handelsübliche mykologische Verpackungen erhältlich. Im Labor wird ein Teil der Probe mit 20-30%iger Kaliumhydroxidlösung versetzt, um das Nagelkeratin aufzuweichen, so dass die Probe durch direkte Mikroskopie auf Pilzelemente untersucht werden kann. Alternativ wird ein Teil jeder Probe in einer nagellösenden Lösung untersucht, die ein Fluorochrom enthält. Ein Beispiel für eine reaktive Lösung ist diese. Sie wird durch Auflösen von 1 g Na2S in 7,5 ml destilliertem Wasser und anschließender Zugabe von 2,5 ml Ethanol hergestellt. Danach werden 10 ml Blankophor oder 20 ml 1%ige wässrige Lösung von Tinopal UNPA-GX (Fluoreszierender Aufheller 28, F3543; Sigma) zu dieser Mischung gegeben.

Schleim aus den Nasennebenhöhlen

Ein diagnostisches Merkmal der allergischen Pilzrhinosinusitis (AFRS) ist das Vorhandensein von eosinophilem, hyphäenhaltigem Schleim, der aus der Nase oder den Nasennebenhöhlen des Patienten entnommen wird, ohne Anzeichen einer Gewebsinvasion durch Pilze. Die Hyphen können in den Nasennebenhöhlen nur spärlich vorhanden sein und lassen sich mit den derzeit verwendeten Färbemitteln nur sehr langsam sichtbar machen. Ohne dieses positive Merkmal werden in der Regel andere Diagnosen gestellt, darunter allergische Rhinosinusitis (ARS) oder eosinophile Muzin-Rhinosinusitis (EMRS). Die Verwendung wesentlich empfindlicherer Diagnosetechniken, wie z. B. Chitinfärbung oder spezifische Anti-Alternaria-Immunfluoreszenzfärbungen, kann jedoch die Sensitivität verbessern. Zu den unterstützenden diagnostischen Merkmalen gehören das Vorhandensein von Charcot-Leyden-Kristallen, knöchernen Erosionen und heterogenen Trübungen mit Sinusausdehnung im CT-Scan.

Ohrkanal und Otitis externa

Trümmer und Sekrete sollten aus dem Gehörgang gewonnen werden. Die direkte mikroskopische Untersuchung zeigt verzweigte Hyphen, knospende Hefezellen oder beides. Bei einer Aspergillus-Infektion sind manchmal die typischen Sporenköpfe zu sehen.

Hornhautausschabung bei Keratitis

Pilzbedingte Keratitis ist ein medizinischer Notfall und muss umgehend erkannt und behandelt werden. Für die mikrobiologische Diagnose eignet sich am besten Material aus dem betroffenen Teil der Hornhaut; das Material kann in Form von Abschabungen aus einem ulzerierten Bereich oder als Biopsie entnommen werden, wenn das Hornhautepithel intakt ist und die Infektion auf das Hornhautstroma beschränkt ist. Hornhautabstriche werden mit einem Instrument wie einem Platinspatel, einer Beaver-Klinge, einem Bard-Parker-Messer Nr. 15 oder einem stumpfen Kataraktmesser gewonnen. Wattestäbchen sind weniger geeignet, um den nekrotischen Hornhautschleim abzutragen. Das Material sollte wiederholt von der Basis und den Rändern des ulzerierten Teils der Hornhaut entnommen werden. Wenn das Material auf ein steriles Medium gestreut wurde, kann dieselbe Klinge oder derselbe Spatel erneut verwendet werden, um zusätzliches Material zu sammeln; wenn das Material jedoch mit einem unsterilen Objektträger in Berührung gekommen ist, muss die Klinge gewechselt werden, während der Spatel abgeflammt und abgekühlt und dann wieder verwendet werden kann.

Die direkte mikroskopische Untersuchung von gefärbten Abstrichen von Hornhautabschabungen ist das schnellste Mittel, um eine Verdachtsdiagnose zu stellen. Bei den septierten hyalinen Hyphen von Fadenpilzen könnte es sich um Arten von Aspergillus, Fusarium oder Acremonium handeln. Es können farbige septierte Hyphen von Phäohyphomyceten wie Curvularia zu sehen sein. Gelegentlich ist Candida spp. die Ursache der Keratitis, so dass Hefen und Hyphen zu sehen sein können, was auf diese Diagnose hindeutet. Die konfokale Mikroskopie kann ein direkteres Mittel zur Feststellung der Diagnose sein.

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a. Hornhautausschabung mit Lactophenol-Baumwollblau zeigt einzelne Hyphen mit Fusarium spp. oder Aspergillus spp. Dr Philip Thomas, Tiruchirappalli ( a &b )
b. Ein weiteres mit Lactophenol-Baumwollblau gefärbtes Hornhautkratzen zeigt perlschnurartige septierte Hyphen, die weder für Fusarium spp. noch für Aspergillus spp. typisch sind, sondern eher mit einem entmilzten (d. h. braun gefärbten) Pilz übereinstimmen

Gewebe und Peritonealflüssigkeiten
Der mikroskopische Nachweis typischer knospender Hefezellen, Pseudohyphen und/oder echter Hyphen von Candida-Arten in Gewebeschnitten oder normalerweise sterilen Körperflüssigkeiten ist ein Hinweis auf eine invasive Candidose. Typischerweise produziert C. glabrata nur Hefezellen, und nur C. albicans produziert echte Hyphen in Geweben

Grammfärbung einer zentrifugierten Flüssigkeit (in diesem Fall Urin), die C.

Atemwegsproben
Die Untersuchung des Sputums ist bei ABPA hilfreich, da man oft Hyphen mit Eosinophilen und Charcot-Leyden-Kristallen sehen kann. Gelegentlich können seltene Pilzinfektionen durch Mikroskopie diagnostiziert werden, wenn Kügelchen oder große Hefen wie Blastomyces dermatitidis sichtbar werden. Aspergillus oder andere fadenförmige Hyphen können in bronchialem Waschmaterial von Pilztracheobronchitis gesehen werden, manchmal mit sichtbaren Sporen. Bei invasiver pulmonaler Aspergillose aus BAL-Proben ist die Ausbeute der Mikroskopie höher als die der Kultur, in einigen Zentren abhängig von der verwendeten Methode. In keiner Studie wurden die Methoden für die Mikroskopie oder die Ausbeute von Pilzkulturen verglichen.

Lichtmikroskopisch mit KOH untersuchter Schleimpfropf, der ein für Aspergillus typisches Netzwerk hyaliner verzweigter Hyphen zeigt, von einem Patienten mit ABPA.

Das gleiche Präparat einer BAL-Probe mit hyalinen, septierten Hyphen, die mit Aspergillus übereinstimmen, gefärbt mit Blankophor links und KOH rechts.

KOH-Präparat einer Atemwegsflüssigkeit mit breiten, nicht septierten Hyphen, die typisch für Zygomyceten sind.

Blutfilm oder Knochenmark

Die Sensitivität der Mikroskopie von Blut und Knochenmark ist bei den meisten Pilzinfektionen nicht hoch genug, um den Zeitaufwand für die Untersuchung der Proben zu rechtfertigen, mit Ausnahme der disseminierten Histoplasmose und Penicillium marneffei, meist bei AIDS.

Mycetom-Körner

Die Diagnose eines Mycetoms hängt von der Identifizierung der Körner ab, die vorzugsweise mit einer sterilen Nadel aus einer nicht aufgebrochenen Pustel (Sinus) gewonnen werden sollten. Das Dach der Läsion sollte abgehoben und der Sinusinhalt, einschließlich der Körner, herausgepresst und auf einen Objektträger gelegt werden. Jedes Körnchen sollte entnommen, in 70 %igem Alkohol gespült und dann in steriler Kochsalzlösung gewaschen werden, bevor eine Kultur angelegt wird. Die direkte mikroskopische Untersuchung der Körner in 20-prozentigem Kaliumhydroxid bestätigt die Diagnose eines Mycetoms und gibt Aufschluss darüber, ob es sich bei dem verursachenden Organismus um einen Pilz oder einen Actinomyceten handelt. Schwarze Körner deuten auf eine Pilzinfektion hin; winzige weiße Körner deuten oft auf eine Nocardiinfektion hin, und größere weiße Körner von der Größe eines Stecknadelkopfes können entweder pilzlichen oder aktinomykotischen Ursprungs sein. Kleine, rote Körner sind spezifisch für Actinomadura pelletieri, aber gelblich-weiße Körner können aktinomykotischen oder pilzlichen Ursprungs sein. Aktinomykotische Körner enthalten sehr feine Fäden (<1 um Durchmesser), während Pilzkörner Massen von kurzen, verwickelten Hyphen (2-4 um Durchmesser) enthalten, die manchmal pigmentiert sind.

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