1.4.3.2 Moskitos
Moskitos sind Überträger schwerer menschlicher Krankheiten wie Malaria, Dengue-Fieber und Gelbfieber, und trotz der Bemühungen, sie zu kontrollieren, bleiben sie ein ernstes Problem. Die Identifizierung neuartiger Moskito-Gene, die am Geruchssinn, der Blutspeisung, der Verdauung, der Fortpflanzung, der Immunität usw. beteiligt sind, soll die Grundlage für die Entwicklung neuartiger Methoden zur Kontrolle von Moskito-Populationen und durch Moskitos übertragenen Krankheiten bilden (Chen et al., 2008).
Die jüngsten Genomsequenzinformationen für drei wichtige Moskito-Vektoren, Anopheles gambiae, Aedes aegypti und Culex pipiens quinquefasciatus (http://www.vectorbase.org/), wurden für vergleichende Genomik- und Transkriptionsprofilstudien verwendet, die die Identifizierung einer großen Anzahl neuer Moskito-Gene ermöglichen. RNAi hat sich schnell zum Mittel der Wahl für die Charakterisierung von Genfunktionen in verschiedenen Bereichen der Moskito-Biologie und der Moskito-Pathogen-Interaktionen entwickelt (z. B. Fragkoudis et al., 2009). Dies hat zur Veröffentlichung zahlreicher funktioneller RNAi-Tests in dieser Organismengruppe geführt, darunter Mitglieder der Aedinen (A. aegypti, Armigeres subalbtus und C. pipiens) und Anophelines (A. gambiae und Anopheles stephensi). Die meisten dieser Studien haben sich jedoch auf nur zwei Arten konzentriert: den Hauptüberträger von Dengue und Gelbfieber, A. aegypti, und den afrikanischen Malariaüberträger, A. gambiae (Tabelle 1.1).
In diesen Studien umfasste die typische experimentelle Strategie die Mikroinjektion von dsRNA in den Thorax erwachsener Mücken, gefolgt von der Fütterung, der Beaufschlagung mit Krankheitserregern, Geruchsstoffen, Insektiziden oder Stressbedingungen und der anschließenden Untersuchung der Mücken, um die phänotypische Wirkung des Silencing des Zielgens auf den untersuchten physiologischen Prozess zu analysieren, einschließlich Geruch, Fütterung, Verdauung und Stoffwechsel, Stress, Entgiftung, Kutikelbildung, Fortpflanzung, Immunität und Diapausenregulation. Im Folgenden werden einige repräsentative Studien über RNAi bei Stechmücken vorgestellt.
Der Geruchssinn vermittelt eine breite Palette von Verhaltensweisen sowohl erwachsener als auch larvenförmiger Stechmücken, einschließlich der Nahrungsaufnahme, der Wirtspräferenz, der Partnerwahl und der Brutplätze für die Eiablage. Der Geruchssinn umfasst die Wahrnehmung chemischer Reize, die von Geruchsmolekülen ausgehen, und die Entwicklung spezifischer Reaktionen auf diese Reize. Geruchsstoffe werden von geruchsstoffbindenden Proteinen (OBP) aufgenommen, die sie zu den Geruchsstoffrezeptoren (OR) an den dendritischen Membranen der Geruchsneuronen transportieren. Jüngste RNAi-Targetings von OBP- und OR-Genen haben wertvolle Informationen über ihre Funktion im Riechmechanismus und ihre Spezifität geliefert (Biessmann et al., 2010; Liu et al., 2010; Pelletier et al., 2010), was die Möglichkeit eröffnet, die Geruchswahrnehmung und damit eine Reihe von Verhaltensweisen zu modifizieren, die zur Verhinderung von Mückenstichen und Paarungen führen könnten.
In gemäßigten Klimazonen überwintern erwachsene weibliche Mücken in der Diapause, einer Ruhephase, die durch das Fehlen von Verhalten bei der Wirtssuche, die Anhäufung großer Fettreserven und einen Stillstand der Eierstockentwicklung gekennzeichnet ist. Eine Manipulation der Regulierung dieser Dormanzphase könnte beispielsweise dazu führen, dass die Mücken in eine Ruhephase versetzt werden, in der sie nicht auf der Suche nach dem Wirt sind. Dies wurde in mehreren Studien von Dr. Denlingers Team veranschaulicht. Insbesondere haben sie kürzlich RNAi eingesetzt, um den Diapause-Mechanismus in C. pipiens zu untersuchen und die Beteiligung des Insulin/FOXO-Signalwegs an der Regulierung der Diapause nachzuweisen (Sim und Denlinger, 2008, 2009a). Sie haben auch Beweise für die Beteiligung einiger Fettsäuresynthasen an der Akkumulation von Fettreserven in überwinternden Weibchen (Sim und Denlinger, 2009b) und für die Rolle der ribosomalen Proteine S3 und S2 bei der Follikelentwicklung in nicht-diapausierenden Weibchen (Kim und Denlinger, 2010; Kim et al., 2010).
Vitellogenese und Fortpflanzung wurden auch durch RNAi in Stechmücken charakterisiert. Ähnlich wie bei den Zecken benötigen anautogene Stechmücken die Aufnahme von Wirbeltier-Wirtsblut, um einen Fortpflanzungszyklus mit Eiproduktion zu initiieren. Die aus der Blutmahlzeit stammenden Aminosäuren (AA) werden vom Fettkörper der Stechmücke zur Synthese von Dotterproteinvorläufern, hauptsächlich Vitellogenin (Vg), in einem als Vitellogenese bezeichneten Prozess verwendet. Vg wird dann in die Hämolymphe freigesetzt, von den Eierstöcken aufgenommen und über ein spezifisches VgR in die sich entwickelnden Eizellen eingeschleust.
In der Stechmücke A. aegypti wurde die Expression des Vg-Gens vom Team von Dr. Raikhel in einer langen Reihe von eleganten Experimenten intensiv untersucht, bei denen sie RNAi als Werkzeug für die umgekehrte funktionelle Genomik verwendeten. Das Team wies nach, dass die Transkription des Vg-Gens durch das Zusammenspiel mehrerer Moleküle, einschließlich der Kaskade des Steroidhormons 20-Hydroxyecdyson (20E) und der AA/Target-of-Rapamycin (TOR)-Signalübertragung aus der Nahrung, streng reguliert wird. Diese Serin/Threonin-Kinase ist für die Weiterleitung des AA-Signals verantwortlich und aktiviert die Phosphorylierung der S6-Kinase, die für die Aktivierung der Translationsvorgänge erforderlich ist (Park et al., 2006; Roy und Raikhel, 2011). Darüber hinaus hat dasselbe Team durch die Injektion eines spezifischen Antagomirs eine RNAi-vermittelte Deletion der miRNAi miR-27 bewirkt, um die Funktion von miR-27 als positiver Regulator sowohl bei der Blutverdauung als auch bei der Eientwicklung zu demonstrieren. Tatsächlich wird miR-27 als solches durch die 20E- und AA/TOR-Signalwege reguliert (Bryant et al., 2010).
Das angeborene Immunsystem von Mückenvektoren umfasst drei funktionelle Kategorien von Genen, die an der Erkennung von Krankheitserregern beteiligt sind, Signalwege, die die Signalverstärkung, -modulation und -transduktion vermitteln, sowie Effektormechanismen, die die Beseitigung von Krankheitserregern durch den Wirt vermitteln (Baton et al., 2008). RNAi ist selbst ein wichtiger antiviraler Immunmechanismus in Stechmücken. Bei der RNA-basierten antiviralen Immunität wird virale dsRNA erkannt und vom Dicer der Stechmücke zu siRNAs verarbeitet. Anschließend steuern diese vom Virus stammenden siRNAs die spezifische antivirale Immunität durch RNAi und verwandte RNA-Silencing-Effektormechanismen (Ding, 2010). Zahlreiche Arbeiten berichten über den Einsatz von RNAi zur Charakterisierung der Funktion von Moskito-Immungenen. Studien zu allgemeinen Immunmechanismen und -effektoren konzentrierten sich auf Mustererkennungsrezeptoren, Moleküle des antibakteriellen und antimykotischen Signalwegs und Proteine, die an anderen zellulären Effektormechanismen beteiligt sind (Übersicht in Dong et al., 2006; Moita et al., 2005; Shin et al., 2003, 2006; Wang et al., 2006).
RNAi wurde auch zur Charakterisierung der Schnittstelle zwischen Moskito und Erreger eingesetzt, wobei viele Untersuchungen immunbezogene Moskito-Moleküle untersuchten. Molekulare Wechselwirkungen an der Schnittstelle zwischen Moskito und Erreger sichern das Überleben und die Entwicklung sowohl des Erregers als auch des Vektors. Daher ist das Verständnis der molekularen Wechselwirkungen zwischen Krankheitserregern und ihren Moskito-Vektoren von grundlegender Bedeutung für die Entwicklung neuer Bekämpfungsmaßnahmen. In den letzten zehn Jahren wurden intensive Forschungsanstrengungen zur Identifizierung und funktionellen Charakterisierung von Moskito-Genen unternommen, die an pathogen-induzierten Immunreaktionen beteiligt sind, wobei eine Vielzahl von Ansätzen wie vergleichende Genomik, Transkriptionsprofilierung und RNAi-basierte Funktionsanalyse zum Einsatz kamen (Baton et al., 2008). Diese Bemühungen konzentrierten sich hauptsächlich auf zwei Moskito-Pathogen-Assoziationen, A. gambiae-Plasmodium sp. und A. aegypti-dengue virus 2 (DENV-2). Die angeborenen Immunreaktionen der Stechmücken auf eine Infektion mit Arboviren wurden von Fragkoudis et al. (2009) eingehend untersucht, und die Reaktionen auf Malariaparasiten wurden kürzlich von Brown und Catteruccia (2006) und Baton et al. (2008) untersucht, einschließlich RNAi-Ansätzen.
Die meisten dieser RNAi-basierten Studien zielten auf Gene der Immunabwehr der Stechmücken ab und nicht auf Gene, die von den Krankheitserregern benötigt werden, um sich im Stechmückenvektor zu entwickeln. Die meisten der mit RNAi ausgeschalteten Anti-Malaria-Gene sind an der Abtötung von Ookineten und der Melanisierung während des Eindringens in den Mitteldarm beteiligt (Übersicht in Brown und Catteruccia, 2006; Baton et al., 2008). Bei den antiviralen Mückengenen, die dem Knockdown unterzogen wurden, handelt es sich zum Teil um Komponenten von Signalwegen, während andere Teil der RNAi-basierten antiviralen Abwehr sind (Übersicht in Fragkoudis et al., 2009).
Als eine der jüngsten Arbeiten präsentieren Guo et al. (2010) einen nützlichen Ansatz zur Identifizierung neuer A. aegypti-Proteine, die mit DENV-2 interagieren. Die Autoren entwickelten den ersten Entwurf des Moskito-Protein-Interaktionsnetzwerks mit Hilfe eines computergestützten Ansatzes und identifizierten 714 mutmaßliche DENV-assoziierte A. aegypti-Proteine, die sich in vier funktionelle Hauptkategorien gliedern (Replikation/Transkription/Translation, Immunität, Transport und Stoffwechsel). Zehn dieser mutmaßlich DENV-assoziierten Proteine wurden nach dem Zufallsprinzip für die Validierung durch RNAi-vermitteltes Gen-Silencing ausgewählt, und der Dengue-Virustiter im Mückenmagen war bei fünf von ihnen signifikant reduziert.
Insgesamt unterstützen diese Ergebnisse die Vorstellung, dass RNAi ein leistungsfähiges Werkzeug für die Hochdurchsatz-Charakterisierung des Immunsystems von Insekten-Krankheitsüberträgern sein könnte und damit zur Identifizierung und Charakterisierung potenzieller Moskito-Targets für die Entwicklung neuer Methoden zur Kontrolle von Moskito-Populationen, Parasiten in Moskitos und durch Moskitos übertragene Krankheiten beitragen könnte.
Nach der Entdeckung, dass RNAi eine der wichtigsten Abwehrmechanismen der Stechmücke gegen Arboviren ist, wurde berichtet, dass die Unterdrückung dieses Signalwegs die Viruslast in infizierten Stechmücken erhöht (Sanchez-Vargas et al, 2009). Cirimotich et al. (2009) verwendeten ein Sindbis-Virus, das so manipuliert wurde, dass es ein Protein exprimiert, das an dsRNA bindet und diese vermutlich vor der Verarbeitung im RNAi-Weg schützt und somit als RNAi-Suppressor wirkt. Dieses gentechnisch veränderte Virus produziert in infizierten Stechmücken viel mehr Viruspartikel als normal und ist für eine Reihe von Stechmückenarten (A. aegypti, Aedes albopictus, C. trithaeniorhynchus) tödlich. Dieser Ansatz ist ein Beispiel für eine neue, auf Genetik basierende Entwicklung, die für Strategien zur “Populationsunterdrückung” bei der Mückenbekämpfung nützlich sein könnte (Alphey, 2009).
Das gegenteilige Ziel, nämlich die künstliche Verstärkung der RNAi-basierten antiviralen Mückenimmunität, um virusresistente Mücken zu erhalten, wurde ebenfalls entwickelt. Antivirales RNAi wurde eingesetzt, um transgenen A. aegypti-Mücken eine Resistenz gegen DENV zu verleihen, indem eine Haarnadel-RNA exprimiert wurde, die einem Fragment des Virus entspricht (Franz et al., 2009). Durch die Verwendung gewebe- und zeitspezifischer Promotoren kann die Expression der Haarnadel-RNA auf den Mitteldarm – die ersten Zellen, die infiziert werden – und nur nach der Blutmahlzeit beschränkt werden, wodurch potenzielle Probleme für die Fitness der Mücken, die sich aus der konstitutiven Expression einer langen Haarnadel-RNA ergeben, minimiert werden. Eine Diskussion über die Vorteile und Probleme der Verwendung dieser Art von transgenen resistenten Mückenstämmen in “Populationsersatz”-Strategien zur Mückenbekämpfung findet sich in Alphey (2009).