La microscopie est essentielle dans de nombreux aspects de la mycologie. Elle a 3 utilisations principales :

1. Détection des champignons directement dans les spécimens cliniques – les apparences particulières peuvent être très caractéristiques de certaines infections, ie infection à Zygomycètes ou encre d’Inde dans le liquide céphalo-rachidien. La microscopie directe, si elle est positive, est plus rapide que la culture.
2. Confirmation qu’une culture d’un champignon aérien tel qu’Aspergillus est la cause de l’infection et qu’il est peu probable qu’il s’agisse d’un contaminant.
3. Identification des champignons, basée sur les apparences morphologiques.

La section ci-dessous est assez technique et spécifique et écrite pour le travailleur de laboratoire qui souhaite améliorer les taux de détection et les compétences de rapport.

Ce tableau montre les principaux types d’échantillons et les résultats utilisés pour la microscopie directe.

Echantillon	Fongi détectable et aspect
CSF	Yeasts de Cryptococcus	Préparation à l’encre d’Inde.
Coiffures, ongles et raclages cutanés	Hyphes de dermatophytes ou autres champignons filamenteux Yeasts de Candida	Fongiques différents non distinguables. Les cultures sont souvent négatives, donc la microscopie n’est qu’une preuve de l’infection.
Mucus des sinus paranasaux	Les hyphes détectables dans le mucus sont un diagnostic de rhinosinusite fongique éosinophile	Le mucus doit être fixé et coloré comme pour les sections histopathologiques. Les hyphes peuvent être insaisissables.
Débris/grattage d’oreille	Hyphes, généralement avec des têtes sporulantes typiques d’Aspergillus niger.	Occasionnellement mélangés avec des cellules de Candida et de levure.
Décapage cornéen pour kératite	On peut voir des levures ou des champignons filamenteux	Signe précoce utile de kératite mycosique, ne permet pas de distinguer les espèces causales
Aspiration de tissu ou biopsie	Hyphes de champignons filamenteux Yeux de Candida ou autres levures. Sphérules de C. immitis	Certains champignons très distinctifs, notamment de petites levures sans hyphes évoquant C. glabrata, ou des hyphes non septées d’un Zygomycète.
Les fluides respiratoires	Des hyphes sans signification Des hyphes (sans levures) compatibles avec une maladie Pneumocystis jirovecii	Des hyphes habituellement septés et typiques d’Aspergillus, mais si elles ne sont pas septées, il faut envisager une zygomycose ou une mucormycose. Imuunofluorescence supérieure pour P. jirovecii
Film sanguin ou moelle osseuse	Levures intracellulaires typiques d’Histoplasma ou rarement de Penicillium	Une caractéristique de l’histoplasmose disséminée et retrouvée dans 40%.
Fluide péritonéal	Yeux ou rarement hyphes	Utile pour confirmer la présence de Candida. péritonite
Ecouvillon/ frottis vaginal	Candida albicans (levures et hyphes) ou Candida glabrata	Principal test diagnostique
Grain de mycétome	Peut montrer des hyphes avec des caractéristiques	Généralement non définitif en ce qui concerne l’espèce

Méthodologie de conservation

La préparation spécifique la plus ancienne pour la microscopie est une solution concentrée (10-20%) d’hydroxyde de potassium, qui ramollit la kératine et permet la visualisation directe des champignons et une certaine évaluation de la morphologie. Les colorations de Gram sont moins sensibles. Les colorations de Papanicolau peuvent être utiles. Les lames de cytologie peuvent être colorées avec des colorations à l’argent ou à la méthénamine de Gomori (GMS). La microscopie à immunofluorescence est la meilleure méthode pour détecter Pneumocystis. Les azurants fluorescents (Calcofluor blanc, Blankophor ou Tinopal UNPA-GX), qui se lient à la chitine de la paroi cellulaire fongique, sont un moyen rapide de scanner les échantillons pour détecter les hyphes fongiques et améliorer l’évaluation de la morphologie.

Le rôle diagnostique de la microscopie dans des maladies spécifiques

Le LCR et la méningite

Des cellules de Cryptococcus encapsulées peuvent souvent être détectées dans des spécimens de LCR ou d’autres fluides ou sécrétions de l’hôte montés à l’encre de Chine. Environ 50% des patients séronégatifs et plus de 80% des patients séropositifs ont un examen positif à l’encre de Chine du LCR. Cependant, les lymphocytes intacts, en particulier, peuvent être confondus avec l’organisme. Chez les personnes atteintes du SIDA, les cellules de Cryptococcus sont généralement abondantes dans le LCR, bien que les capsules puissent être petites, ce qui rend leur reconnaissance difficile. La persistance de résultats positifs dans le LCR chez des patients sous traitement ne doit être considérée comme une preuve d’échec ou de rechute que si elle est confirmée par une détérioration de l’état clinique du patient ou par des cultures positives.

Préparation à l’encre de Chine du LCR montrant de multiples levures avec de grandes capsules, et des bourgeons étroits vers des cellules filles plus petites, typiques de C. neoformans

Micrographie électronique à transmission d’une cellule de C. neoformans observée dans le LCR chez un patient atteint du SIDA avec remarquablement peu de capsule présente. Ces cellules peuvent être confondues avec des lymphocytes.

Fongus filamenteux dans le LCR d’un patient atteint de méningite qui a cultivé Candida albicans en culture par la suite.

Cheveux

Les spécimens du cuir chevelu doivent inclure les racines des cheveux, le contenu des follicules bouchés et les écailles de la peau. A l’exception des favus, la partie distale des cheveux infectés contient rarement un champignon. Pour cette raison, les cheveux coupés sans racines ne conviennent pas à l’étude mycologique. Une méthode utile pour recueillir du matériel sur le cuir chevelu est l’échantillonnage à l’aide d’une brosse à cheveux.

L’examen microscopique direct du matériel infecté doit révéler des arthroconidies du dermatophyte situées à l’extérieur (ectothrix) ou à l’intérieur (endothrix) du cheveu affecté. Les arthroconidies peuvent être de petite taille (2-4 um de diamètre) ou de grande taille (jusqu’à 10 um de diamètre). Les écailles de la peau contiennent des hyphes et des arthroconidies. Dans l’infection par T. schoenleinii (favus), on observe des chaînes lâches d’arthroconidies et des espaces d’air à l’intérieur des poils affectés. Le scutulum (croûte) est constitué de mycélium, de neutrophiles et de cellules épidermiques.

Décapage de peau montrant des hyphes filamenteux avec blankophor.

Ongles

La qualité du spécimen prélevé est un facteur majeur de réussite ou non de la microscopie et de la culture. Le prélèvement d’un échantillon doit être indolore, à l’exception d’un léger inconfort occasionnel lorsque des échantillons sous-unguéaux sont prélevés. La figure ci-dessous montre les sites appropriés sur lesquels les spécimens d’ongles doivent être prélevés,

Les raclages prélevés avec un scalpel émoussé ou les coupures doivent être transportés dans un carré de papier plié, de préférence fixé avec un trombone, mais des paquets mycologiques commerciaux sont également disponibles. Au laboratoire, une solution d’hydroxyde de potassium à 20-30% est ajoutée à une partie de l’échantillon pour faire macérer la kératine de l’ongle afin que l’échantillon puisse être examiné pour les éléments fongiques par microscopie directe. Alternativement, une partie de chaque échantillon est examinée dans une solution dissolvant les ongles et contenant un fluorochrome. Voici un exemple de solution réactive. Elle est préparée en dissolvant 1 g de Na2S dans 7,5 ml d’eau distillée et en ajoutant ensuite 2,5 ml d’éthanol. Ensuite, on ajoute à ce mélange 10 ml de Blankophor ou 20 ml de solution aqueuse à 1% de Tinopal UNPA-GX (azurant fluorescent 28, F3543 ; Sigma).

Mucus des sinus paranasaux

Une caractéristique diagnostique de la rhinosinusite fongique allergique (SRFA) est la présence d’hyphes contenant de la mucine éosinophile, recueillis dans le nez ou les cavités des sinus paranasaux du patient sans preuve d’invasion des tissus par le champignon. Les hyphes peuvent être rares dans le contenu des sinus et prendre beaucoup de temps à être visualisés avec les colorants actuellement utilisés. Sans cette caractéristique positive, d’autres diagnostics sont généralement posés, notamment la rhinosinusite allergique (ARS) ou la rhinosinusite à mucine éosinophile (EMRS). Cependant, l’utilisation de techniques de diagnostic beaucoup plus sensibles, comme la coloration de la chitine ou les colorations spécifiques d’immunofluorescence anti-Alternaria, peut améliorer la sensibilité. Les caractéristiques diagnostiques de soutien comprennent la présence de cristaux de Charcot-Leyden, d’érosion osseuse et d’opacité hétérogène avec expansion des sinus sur le scanner.

Conduit auditif et otite externe

Des débris et des sécrétions doivent être obtenus à partir du conduit auditif. L’examen microscopique direct révélera des hyphes ramifiés, des cellules de levure bourgeonnantes ou les deux. Dans les cas d’infection à Aspergillus, les têtes de sporulation typiques peuvent parfois être vues.

Récapage cornéen pour kératite

La kératite fongique est une urgence médicale et doit être reconnue et traitée rapidement. Pour le diagnostic microbiologique, le meilleur spécimen est le matériel de la partie affectée de la cornée ; le matériel peut être collecté sous forme de raclages d’une zone ulcérée ou d’une biopsie lorsque l’épithélium cornéen est intact et l’infection confinée au stroma cornéen. Les raclages cornéens sont obtenus à l’aide d’un instrument tel qu’une spatule en platine, une lame Beaver, un couteau Bard Parker n°15 ou un couteau émoussé pour cataracte. Les cotons-tiges sont moins efficaces pour débrider le bourrelet cornéen nécrotique. Le matériel doit être prélevé à plusieurs reprises à la base et sur les bords de la partie ulcérée de la cornée. Si le matériel a été étalé sur un milieu stérile, la même lame ou spatule peut être réutilisée pour recueillir du matériel supplémentaire ; cependant, si le matériel est entré en contact avec une lame de microscope non stérile, la lame doit être changée tandis que la spatule peut être flambée, refroidie puis réutilisée.

L’examen microscopique direct des frottis colorés du matériel de grattage cornéen est le moyen le plus rapide de poser un diagnostic présomptif. Les hyphes hyalins septés de champignons filamenteux observés pourraient représenter des espèces d’Aspergillus, Fusarium ou Acremonium. Des hyphes septés colorés de phaeohyphomycètes tels que Curvularia peuvent être vus. Parfois, Candida spp. est à l’origine de la kératite et des levures et hyphes peuvent être observés, ce qui suggère ce diagnostic. La microscopie confocale peut être un moyen plus direct d’établir le diagnostic.

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a. Un grattage cornéen au bleu de coton lactophénol montre des hyphes séparés avec Fusarium spp ou Aspergillus spp. Dr Philip Thomas, Tiruchirappalli ( a &b )
b. Un autre raclage cornéen coloré au bleu de coton lactophénol montrant des hyphes septés perlés non typiques de Fusarium spp ou Aspergillus spp, étant plus cohérent avec un champignon dématice (c’est-à-dire de couleur brune)

Tissus et fluides péritonéaux
La détection au microscope de cellules de levure bourgeonnantes typiques, de pseudohyphes et/ou d’hyphes véritables d’espèces de Candida dans des sections de tissus ou des fluides corporels normalement stériles indique une candidose invasive. Typiquement, C. glabrata ne produit que des cellules de levure, et seul C. albicans produit de véritables hyphes dans les tissus

Transparence graphique d’un fluide centrifugé (dans ce cas l’urine) contenant C. albicans, montrant les formes de levure et d’hyphes, si souvent observées dans ce type de spécimen.

Échantillons respiratoires
L’examen des expectorations est utile dans l’ABPA car des hyphes peuvent souvent être observés avec des éosinophiles et des cristaux de Charcot Leyden. Occasionnellement, des infections fongiques peu communes peuvent être diagnostiquées par microscopie lorsque des sphérules ou de grandes levures telles que Blastomyces dermatitidis sont visualisées. Aspergillus ou d’autres hyphes filamenteux peuvent être observés dans le matériel de lavage bronchique d’une trachéobronchite fongique, avec parfois des têtes sporulantes visibles. La microscopie a un rendement plus élevé que la culture dans l’aspergillose pulmonaire invasive à partir d’échantillons de LBA, dans certains centres selon la méthode utilisée. Aucune étude n’a comparé les méthodologies de microscopie ou le rendement des cultures fongiques.

Plaque muqueuse examinée en microscopie optique avec du KOH, montrant un réseau d’hyphes hyalines ramifiées typiques d’Aspergillus, provenant d’un patient atteint d’ABPA.

La même préparation d’un spécimen de LBA montrant des hyphes hyalines et cloisonnées compatibles avec Aspergillus, colorées au Blankophor à gauche et au KOH à droite.

Préparation KOH d’un fluide respiratoire montrant de larges hyphes non septées, typiques d’un Zygomycète.

Film sanguin ou moelle osseuse

La sensibilité de la microscopie du sang et de la moelle osseuse n’est pas assez élevée pour la plupart des infections fongiques pour justifier le temps d’examen des échantillons, à l’exception de l’histoplasmose disséminée et du Penicillium marneffei, généralement dans le SIDA.

Grain de mycétome

Le diagnostic de mycétome dépend de l’identification des grains qui doivent être obtenus de préférence à partir d’une pustule non rompue (sinus) en utilisant une aiguille stérile. Le toit de la lésion doit être soulevé et le contenu du sinus, y compris les grains, doit être pressé et placé sur une lame de verre. Chaque grain doit être prélevé, rincé dans de l’alcool à 70 %, puis lavé dans une solution saline stérile avant d’être mis en culture. L’examen microscopique direct des grains dans de l’hydroxyde de potassium à 20 % confirmera le diagnostic de mycétome et révélera également si l’organisme responsable est un champignon ou un actinomycète. Les grains noirs suggèrent une infection fongique ; les minuscules grains blancs indiquent souvent une infection à Nocardia et les grains blancs plus gros, de la taille d’une tête d’épingle, peuvent être d’origine fongique ou actinomycosique. Les petits grains rouges sont spécifiques à Actinomadura pelletieri, mais les grains blancs jaunâtres peuvent être d’origine actinomycosique ou fongique. Les grains actinomycosiques contiennent des filaments très fins (<1 um de diamètre), alors que les grains fongiques contiennent des masses d’hyphes courtes enchevêtrées (2-4 um de diamètre) qui sont parfois pigmentées.

Denning DW, Evans EGV, Kibbler CC, Richardson MD, Roberts MM, Rogers TR, Warnock DW, Warren RE. Fungal nail disease : a guide to good practice (Rapport d’un groupe de travail de la British Society for Medical Mycology). Br Med J 1995 ; 311 : 1277-1281.

Monod M, Baudraz-Rosselet F, Ramelet AA, Frenk E. Examen mycologique direct en dermatologie : une comparaison de différentes méthodes. Dermatologica. 1989;179(4):183-6. PMID : 2695355

Procop GW, Haddad S, Quinn J, Wilson ML, Henshaw NG, Reller LB, Artymyshyn RL, Katanik MT, Weinstein MP. Détection de Pneumocystis jiroveci dans les spécimens respiratoires par quatre méthodes de coloration. J Clin Microbiol. 2004 Jul;42(7):3333-5. PubMed PMID : 15243109 ; PubMed Central PMCID : PMC446244.