1.4.3.2 Moustiques
Les moustiques sont des vecteurs de maladies humaines graves telles que le paludisme, la dengue et la fièvre jaune, et malgré les efforts pour les contrôler, ils restent un problème sérieux. L’identification de nouveaux gènes de moustiques impliqués dans l’olfaction, l’alimentation sanguine, la digestion, la reproduction, l’immunité, etc. devrait fournir les bases pour le développement de nouvelles méthodes de contrôle des populations de moustiques et des maladies transmises par les moustiques (Chen et al, 2008).
Les informations récentes sur la séquence du génome de trois principaux moustiques vecteurs, Anopheles gambiae, Aedes aegypti, et Culex pipiens quinquefasciatus (http://www.vectorbase.org/), ont été utilisées pour des études de génomique comparative et de profilage transcriptionnel qui permettent l’identification de grands tableaux de nouveaux gènes de moustiques. L’ARNi est rapidement devenu l’outil de choix pour caractériser la fonction des gènes dans divers domaines de la biologie des moustiques et des interactions moustiques-pathogènes (par exemple, Fragkoudis et al., 2009). Cela a donné lieu à la publication de très nombreux essais fonctionnels d’ARNi dans ce groupe d’organismes, y compris les membres des aedines (A. aegypti, Armigeres subalbtus et C. pipiens) et des anophèles (A. gambiae et Anopheles stephensi). La plupart de ces études se sont toutefois concentrées sur deux espèces seulement : le principal vecteur de la dengue et de la fièvre jaune, A. aegypti, et le vecteur africain du paludisme, A. gambiae (tableau 1.1).
Dans ces études, la stratégie expérimentale typique consistait en une micro-injection d’ARNdb dans le thorax de moustiques adultes, suivie d’une alimentation, d’un défi avec des agents pathogènes, des odorants, des insecticides ou des conditions de stress, et de l’examen ultérieur des moustiques pour analyser l’effet phénotypique de l’extinction du gène ciblé sur le processus physiologique étudié, y compris l’olfaction, l’alimentation, la digestion et le métabolisme, le stress, la détoxification, la formation de cuticules, la reproduction, l’immunité et la régulation de la diapause. Dans ce qui suit, nous présentons quelques études représentatives de l’ARNi chez les moustiques.
L’olfaction est le médiateur d’un large éventail de comportements des moustiques adultes et larvaires, y compris l’alimentation, la préférence de l’hôte, la localisation/sélection du partenaire et les sites de reproduction pour la ponte. L’olfaction implique la perception de stimuli chimiques fournis par des molécules odorantes et le développement de réponses spécifiques à ces stimuli. Les odorants sont capturés par des protéines de liaison aux odorants (OBP), qui les transportent vers les récepteurs d’odorants (OR) sur les membranes dendritiques des neurones olfactifs. Le ciblage récent par ARNi des gènes OBP et OR a fourni des informations précieuses sur leur fonction dans le mécanisme et la spécificité de l’olfaction (Biessmann et al., 2010 ; Liu et al., 2010 ; Pelletier et al, 2010), ouvrant la possibilité de modifier la perception de l’olfaction et donc une gamme de comportements qui pourraient aboutir à la prévention de la piqûre et de l’accouplement des moustiques.
Dans les climats tempérés, les moustiques femelles adultes hivernent en diapause, une période de dormance qui se caractérise par l’absence de comportement de recherche d’hôte, l’accumulation d’énormes réserves de graisse et un arrêt du développement ovarien. La manipulation de la régulation de cet épisode de dormance pourrait aboutir, par exemple, à l’induction de moustiques dormants, ne recherchant pas d’hôte. Plusieurs études menées par l’équipe du Dr Denlinger en sont la preuve. En particulier, ils ont récemment utilisé l’ARNi pour étudier le mécanisme de la diapause chez C. pipiens, pour mettre en évidence la participation de la voie de signalisation insuline/FOXO dans la régulation de la diapause (Sim et Denlinger, 2008, 2009a). Ils ont également mis en évidence l’implication de certaines synthases d’acides gras dans l’accumulation des réserves de graisse chez les femelles hivernantes (Sim et Denlinger, 2009b), et le rôle des protéines ribosomales S3 et S2 dans le développement des follicules chez les femelles non diapausées (Kim et Denlinger, 2010 ; Kim et al., 2010).
La vitellogenèse et la reproduction ont également été caractérisées par ARNi chez les moustiques. Comme chez les tiques, les moustiques anautogènes ont besoin de l’apport de sang d’un hôte vertébré pour initier un cycle de reproduction impliquant la production d’œufs. Les acides aminés (AA) dérivés du repas sanguin sont utilisés par le corps gras du moustique pour synthétiser les précurseurs des protéines vitellines, principalement la vitellogénine (Vg), dans un processus appelé vitellogénèse. La Vg est ensuite libérée dans l’hémolymphe, puis captée par les ovaires et déposée dans les ovocytes en développement par l’intermédiaire d’un VgR spécifique.
Dans le moustique A. aegypti, l’expression du gène Vg a été intensivement étudiée par l’équipe du Dr Raikhel dans une longue série d’expériences élégantes, dans lesquelles ils ont utilisé l’ARNi comme outil de génomique fonctionnelle inverse. Cette équipe a démontré que la transcription du gène Vg est étroitement régulée par les apports combinés de plusieurs molécules, dont la cascade de l’hormone stéroïde 20-hydroxyecdysone (20E) et la signalisation nutritionnelle AA/Target-of-Rapamycin (TOR). Cette sérine/thréonine kinase est responsable de la transduction du signal AA, activant la phosphorylation de la kinase S6 qui est nécessaire à l’activation des événements traductionnels (Park et al., 2006 ; Roy et Raikhel, 2011). De plus, en injectant un antagomir spécifique, la même équipe a produit une déplétion médiée par ARNi du miRNAi miR-27 afin de démontrer la fonction du miR-27 comme régulateur positif à la fois dans la digestion du sang et le développement de l’œuf. En fait, miR-27 en soi est régulé par les voies 20E et AA/TOR (Bryant et al., 2010).
Le système immunitaire inné des moustiques vecteurs comprend trois catégories fonctionnelles de gènes impliqués dans la reconnaissance des pathogènes, les voies de signalisation médiant l’amplification, la modulation et la transduction des signaux et les mécanismes effecteurs médiant la clairance des pathogènes de l’hôte (Baton et al., 2008). L’ARNi est lui-même un mécanisme immunitaire antiviral majeur chez les moustiques. Dans l’immunité antivirale basée sur l’ARN, le dsRNA viral est reconnu et transformé en siRNA par le Dicer du moustique. Ensuite, ces siRNA dérivés du virus guident l’immunité antivirale spécifique par le biais de l’ARNi et de mécanismes effecteurs de silençage de l’ARN connexes (Ding, 2010). De nombreux articles font état de l’utilisation de l’ARNi pour caractériser la fonction des gènes immunitaires des moustiques. Les études sur les mécanismes immunitaires généraux et les effecteurs se sont concentrées sur les récepteurs de reconnaissance des formes, les molécules de la voie de signalisation antibactérienne et antifongique et les protéines impliquées dans d’autres mécanismes effecteurs cellulaires (revus dans Dong et al., 2006 ; Moita et al., 2005 ; Shin et al., 2003, 2006 ; Wang et al., 2006).
L’ARNi a également été utilisé dans la caractérisation de l’interface moustique-pathogène, de nombreuses enquêtes portant sur les molécules du moustique liées à l’immunité. Les interactions moléculaires à l’interface moustique-pathogène assurent la survie et le développement à la fois du pathogène et du vecteur. Par conséquent, la compréhension des interactions moléculaires entre les agents pathogènes et leurs moustiques vecteurs est fondamentale pour le développement de nouvelles mesures de contrôle. Au cours de la dernière décennie, un effort de recherche intense a été déployé pour l’identification et la caractérisation fonctionnelle des gènes de moustiques impliqués dans les réponses immunitaires induites par les pathogènes en utilisant une variété d’approches, y compris la génomique comparative, le profilage transcriptionnel et l’analyse fonctionnelle basée sur l’ARNi (Baton et al., 2008). Ces efforts se sont principalement concentrés sur deux associations moustique-pathogène, A. gambiae-Plasmodium sp. et A. aegypti-dengue virus 2 (DENV-2). Les réponses immunitaires innées des moustiques à l’infection par les arbovirus ont été examinées en détail par Fragkoudis et al. (2009), et celles aux parasites du paludisme ont été récemment examinées par Brown et Catteruccia (2006) et Baton et al. (2008), y compris les approches ARNi.
La plupart de ces études basées sur l’ARNi ont ciblé les gènes des mécanismes de défense immunitaire des moustiques plutôt que les gènes nécessaires aux pathogènes pour se développer dans le moustique vecteur. En ce qui concerne les gènes anti-paludisme des moustiques soumis à l’élimination par ARNi, la plupart d’entre eux sont ceux impliqués dans la destruction des ookinètes et la mélanisation pendant la pénétration dans l’intestin moyen (examinés dans Brown et Catteruccia, 2006 ; Baton et al., 2008). En ce qui concerne les gènes antiviraux du moustique soumis au knock-down, certains sont des composants des voies de signalisation, tandis que d’autres font partie de la défense antivirale basée sur l’ARNi (revue dans Fragkoudis et al., 2009).
Parmi les articles les plus récents, Guo et al. (2010) présentent une approche utile pour identifier de nouvelles protéines d’A. aegypti interagissant avec DENV-2. Ces auteurs ont développé la première ébauche du réseau d’interaction des protéines du moustique en utilisant une approche computationnelle et ont identifié 714 protéines A. aegypti putatives associées au DENV qui se regroupent en quatre catégories fonctionnelles principales (réplication/transcription/translation, immunité, transport et métabolisme). Dix de ces protéines putatives associées au DENV ont été sélectionnées au hasard pour être validées par un silençage génique médié par l’ARNi, et le titre viral de la dengue dans les entrailles des moustiques a été significativement réduit pour cinq d’entre elles.
Collectivement, ces résultats soutiennent la notion que l’ARNi pourrait être un outil puissant pour la caractérisation à haut débit du système immunitaire des insectes vecteurs de maladies, contribuant ainsi à l’identification et à la caractérisation des cibles potentielles des moustiques pour le développement de nouvelles méthodes de contrôle des populations de moustiques, des parasites à l’intérieur des moustiques et des maladies transmises par les moustiques.
Après la découverte que l’ARNi est l’une des principales défenses du moustique contre les arbovirus, il a été signalé que la suppression de cette voie augmente la charge virale chez les moustiques infectés (Sanchez-Vargas et al, 2009). Cirimotich et al. (2009) ont utilisé un virus Sindbis modifié pour exprimer une protéine qui se lie à l’ARNdb et le protège vraisemblablement du traitement dans la voie de l’ARNi, agissant ainsi comme un suppresseur d’ARNi. Ce virus modifié produit beaucoup plus de particules virales que la normale dans les moustiques infectés et est létal pour une série d’espèces de moustiques (A. aegypti, Aedes albopictus, C. trithaeniorhynchus). Cette approche est un exemple de nouveau développement basé sur la génétique, potentiellement utile dans les stratégies de ” suppression de population ” pour le contrôle des moustiques (Alphey, 2009).
Le but opposé, c’est-à-dire le renforcement artificiel de l’immunité antivirale des moustiques basée sur l’ARNi pour obtenir des moustiques résistants aux virus, a également été développé. L’ARNi antiviral a été utilisé pour conférer une résistance au DENV chez des moustiques transgéniques A. aegypti, en exprimant un ARN en épingle à cheveux correspondant à un fragment du virus (Franz et al., 2009). En utilisant des promoteurs spécifiques aux tissus et au temps, l’expression de l’ARN en épingle à cheveux peut être limitée à l’intestin moyen – les premières cellules à être infectées – et seulement après le repas de sang, minimisant les problèmes potentiels pour la condition physique du moustique dérivés de l’expression constitutive d’un ARN en longue épingle à cheveux. Une discussion sur les avantages et les problèmes de l’utilisation de ce type de souches de moustiques résistants transgéniques dans les stratégies de ” remplacement de population ” pour le contrôle des moustiques peut être trouvée dans Alphey (2009).