A mikroszkópia a mikológia számos területén elengedhetetlen. 3 fő felhasználási területe van:

1. Gombák kimutatása közvetlenül a klinikai mintákban – a különleges megjelenések nagyon jellemzőek lehetnek bizonyos fertőzésekre, pl. Zygomycete fertőzés vagy India Ink az agy-gerincvelői folyadékban. A közvetlen mikroszkópos vizsgálat, ha pozitív, gyorsabb, mint a tenyésztés.
2. A levegőben terjedő gomba, például Aspergillus tenyészetének megerősítése, hogy a fertőzés okozója, és nem valószínű, hogy szennyeződés.
3. Gombák azonosítása morfológiai megjelenés alapján.

Az alábbi szakasz meglehetősen technikai és specifikus, és olyan laboratóriumi dolgozók számára íródott, akik javítani kívánják a kimutatási arányokat és a jelentési készségeket.

A táblázat a közvetlen mikroszkópos vizsgálathoz használt főbb mintatípusokat és leleteket mutatja.

Minta	Mutatható gombák és megjelenés
CSF	Cryptococcus ivarsejtek	India tinta készítmény.
Haj-, köröm- és bőrkaparék	Dermatofita vagy más fonalas gombák méhsejtjei Candida méhsejtjei	Más gombák nem megkülönböztethetők. A tenyészetek gyakran negatívak, így a mikroszkópia csak a fertőzés bizonyítéka.
A melléküregekből származó nyálka	A nyálkában kimutatható nyák az eozinofil gombás rhinosinusitis diagnosztikája	A nyákot fixálni és festeni kell, mint a szövettani metszeteket. A hifák nehezen kivehetők.
Fültörmelék/kaparás	Hifák, általában az Aspergillus nigerre jellemző spórás fejjel.	Egyébként Candida- és élesztősejtekkel keverve.
Korneális kaparás keratitisz esetén	Istek vagy fonalas gombák láthatók	A mikotikus keratitisz hasznos korai jele, nem különbözteti meg a kórokozó fajokat
szöveti aspiráció vagy biopszia	Filamentózus gombák fonalas gombái Candida vagy más élesztőgombák gócai. C. immitis gömböcsei	Egyes gombák igen jellegzetesek, beleértve a C. glabrata-ra utaló kis élesztőgombákat hifák nélkül, vagy egy Zygomycete nem szeptikus hifáit.
Légzőszervi folyadékok	Szignifikáns jelentőséggel nem bíró gombák Betegséggel összhangban lévő (élesztőgombák nélküli) hipofágok Pneumocystis jirovecii	Az Aspergillusra jellemző, általában szeptikus hipofágok, de ha nem szeptikusak, akkor zigomikózisra vagy mucormikózisra kell gondolni. Imuunofluoreszcencia superior a P. jirovecii számára
Vérfilm vagy csontvelő	A Histoplasma vagy ritkán Penicilliumra jellemző intracelluláris élesztőgombák	A disszeminált histoplasmosis jellemzője és 40%-ban megtalálható.
Peritoneális folyadék	Élesztőgombák vagy ritkán hifák	Hasznos a Candida igazolására. Peritonitis
Vaginális kenet/kenet	Candida albicans (élesztőgombák és hifák) vagy Candida glabrata	Kulcsos diagnosztikai teszt
Mycetoma szemcsék	Megjeleníthet jellegzetes hifákat	A fajok tekintetében általában nem egyértelmű

Módszertan

A legrégebbi specifikus preparátum mikroszkópos vizsgálathoz egy koncentrált (10-20%-os) kálium-hidroxid oldat, amely felpuhítja a keratint, és lehetővé teszi a gombák közvetlen láthatóvá tételét és némi morfológiai értékelést. A Gram-festékek kevésbé érzékenyek. A papanicolau festékek hasznosak lehetnek. A citológiai tárgylemezeket szálkás vagy Gomori Methenamine Silver (GMS) festékkel lehet megfesteni. A Pneumocystis kimutatására az immunfluoreszcens mikroszkópia a legjobb módszer. A fluoreszcens világosítók (Calcofluor white, Blankophor vagy Tinopal UNPA-GX), amelyek a gomba sejtfalában lévő kitinhez kötődnek, gyors eszközt jelentenek a minták gombahifák keresésére, és javítják a morfológiai értékelést.

A mikroszkópia diagnosztikai szerepe specifikus betegségekben

CSF és agyhártyagyulladás

A CSF vagy más gazdanedvek vagy váladékok tustintával montírozott mintáiban gyakran kimutathatók a kapszulázott Cryptococcus sejtek. A HIV-negatív betegek mintegy 50%-ánál és a HIV-pozitív betegek több mint 80%-ánál pozitív a liquor indiántinta-vizsgálata. Azonban különösen az intakt limfociták összetéveszthetők a szervezettel. AIDS-ben szenvedő személyeknél a Cryptococcus sejtek általában bőségesek a liquorban, bár a kapszulák kicsik lehetnek, ami megnehezíti a felismerést. A kezelés alatt álló betegek tartósan pozitív liquorleletei csak akkor tekinthetők a sikertelenség vagy a visszaesés bizonyítékának, ha a beteg klinikai állapotának romlása vagy pozitív tenyésztés igazolja azokat.

India tinta készítmény a liquorból, melyen a C. neoformansra jellemző többszörös élesztőgombák láthatók nagy kapszulákkal és keskeny rügyekkel a kisebb leánysejtekhez

Transzmissziós elektronmikroszkópos felvétel egy C. neoformans sejtről, mely egy AIDS-beteg liquorjában látható, feltűnően kevés kapszulával. Ezek a sejtek összetéveszthetők a limfocitákkal.

Filamentózus gomba egy agyhártyagyulladásban szenvedő beteg liquorjában, amely később tenyészetben Candida albicans-t növesztett.

Haj

A fejbőrből vett mintáknak tartalmazniuk kell a hajgyökereket, a bedugult tüszők tartalmát és a bőrpikkelyeket. A favus kivételével a fertőzött hajszálak disztális része ritkán tartalmaz gombát. Emiatt a gyökerek nélküli levágott hajszálak nem alkalmasak mikológiai vizsgálatra. A fejbőrből történő anyaggyűjtés egyik hasznos módszere a hajkefével történő mintavétel.

A fertőzött anyag közvetlen mikroszkópos vizsgálata során a dermatofita arthrokonídiumait kell felfedezni, amelyek az érintett hajszálon kívül (ectothrix) vagy belül (endothrix) helyezkednek el. Az arthrokonídiumok lehetnek kicsik (2-4 um átmérőjűek) vagy nagyok (akár 10 um átmérőjűek). A bőrpikkelyek hifákat és arthrokonídiumokat tartalmaznak. T. schoenleinii fertőzés (favus) esetén az arthrokonídiumok laza láncai és légterek láthatók az érintett szőrszálakon belül. A scutulum (kéreg) micéliumból, neutrofilekből és epidermális sejtekből áll.

A bőrkaparás filamentózus hifákat mutat blankofórral.

Körmök

A mikroszkópia és a tenyésztés sikerének vagy sikertelenségének egyik fő tényezője a vett minta minősége. A mintavételnek fájdalommentesnek kell lennie, eltekintve az alkalmankénti enyhe kellemetlen érzéstől, amikor szubungvális mintát vesznek. Az alábbi ábra mutatja a megfelelő helyeket, ahonnan körömmintát kell venni,

A tompa szikével vett kaparékokat vagy a nyesedékeket egy összehajtogatott papírnégyzetben kell szállítani, lehetőleg papírkapoccsal rögzítve, de a kereskedelemben kaphatók mikológiai csomagok is. A laboratóriumban 20-30%-os kálium-hidroxid-oldatot adnak a minta egy részéhez a körömkeratin macerálása céljából, hogy a minta közvetlen mikroszkópiával vizsgálható legyen gombás elemekre. Alternatívaként minden minta egy részét fluorokrómot tartalmazó körömoldó oldatban vizsgálják meg. A reaktív oldatra példa a következő. Ezt 1 g Na2S 7,5 ml desztillált vízben történő feloldásával, majd 2,5 ml etanol hozzáadásával állítják elő. Ezt követően 10 ml Blankophor vagy 20 ml Tinopal UNPA-GX (fluoreszcens fényesítő 28, F3543; Sigma) 1%-os vizes oldatát adjuk ehhez az elegyhez.

Nyálkahártya-üregekből származó nyálka

Az allergiás gombás rhinosinusitis (AFRS) diagnosztikus jellemzője a beteg orrából vagy orrmelléküregéből gyűjtött eozinofil, hifákat tartalmazó nyálka jelenléte, a gomba szöveti inváziójának bizonyítéka nélkül. A hifák a melléküregek tartalmában ritkák lehetnek, és a jelenleg használt festékekkel való megjelenítésük jelentős időt vesz igénybe. E pozitív jellemző nélkül általában más diagnózisokat állítanak fel, beleértve az allergiás rhinosinusitist (ARS) vagy az eozinofil mucinos rhinosinusitist (EMRS). A sokkal érzékenyebb diagnosztikai technikák, például a kitinfestés vagy a specifikus anti-Alternaria immunfluoreszcens festékek alkalmazása azonban javíthatja az érzékenységet. A támogató diagnosztikai jellemzők közé tartozik a Charcot-Leyden-kristályok jelenléte, a csontos erózió és a CT-vizsgálaton a sinus kiterjedésével járó heterogén opacitás.

A hallójárat és otitis externa

A hallójáratból törmeléket és váladékot kell venni. A közvetlen mikroszkópos vizsgálat elágazó hifákat, bimbózó élesztősejteket vagy mindkettőt kimutatja. Aspergillus-fertőzés esetén néha a jellegzetes tüskefejek is láthatók.

Korneakaparás keratitisz esetén

A gombás keratitisz orvosi vészhelyzet, amelyet azonnal fel kell ismerni és kezelni kell. A mikrobiológiai diagnózishoz a legjobb minta a szaruhártya érintett részéből származó anyag; az anyagot fekélyes területről származó kaparék vagy biopszia formájában lehet gyűjteni, ha a szaruhártya hámja ép és a fertőzés a szaruhártya strómára korlátozódik. A szaruhártya kaparékot olyan eszközzel nyerik, mint például platina spatula, Beaver penge, Bard Parker 15. sz. kés vagy tompa szürkehályogkés. A vattapamacsok kevésbé hatékonyak a nekrotikus szaruhártya-lerakódás eltávolítására. Az anyagot a szaruhártya kifekélyesedett részének aljáról és széleiről kell ismételten összegyűjteni. Ha az anyag steril táptalajra került, ugyanaz a penge vagy spatula újra használható további anyag gyűjtésére; ha azonban az anyag nem steril mikroszkópos tárgylemezzel érintkezett, a pengét ki kell cserélni, míg a spatula lángra lobbantható, lehűthető, majd újra felhasználható.

A szaruhártya kaparék anyagából készült festett kenetek közvetlen mikroszkópos vizsgálata a leggyorsabb módja a feltételezett diagnózis felállításának. A látott fonalas gombák szeptátos hialin hifái Aspergillus, Fusarium vagy Acremonium fajokat képviselhetnek. A phaeohyphomycetesek, mint például a Curvularia, színes szeptált hifái is láthatók. Alkalmanként a Candida spp. okozza a keratitist, így élesztőgombák és hifák láthatók, ami erre a diagnózisra utal. A konfokális mikroszkópia közvetlenebb eszköze lehet a diagnózis felállításának.

ab
a. szaruhártya kaparás laktofenolos vattakékkel különálló hifákat mutat Fusarium spp vagy Aspergillus spp. Dr. Philip Thomas, Tiruchirappalli ( a &b )
b. Egy másik, laktofenolos pamutkékkel festett szaruhártya-kaparás, amely gyöngyös, szeptikus hifákat mutat, amelyek nem jellemzőek sem a Fusarium spp-re, sem az Aspergillus spp-re, inkább egy dematiceus (azaz barna színű) gombára utalnak

Szövetek és peritoneális folyadékok
A Candida fajok jellegzetes bimbózó élesztősejtjeinek, pszeudohifáinak és/vagy valódi hifáinak mikroszkópos kimutatása szöveti metszetekben vagy normálisan steril testnedvekben invazív candidiasisra utal. Jellemzően a C. glabrata csak élesztősejteket, és csak a C. albicans valódi hifákat termel a szövetekben

Grammafestés egy centrifugált folyadék (ebben az esetben vizelet), amely C. albicans-t tartalmazó mintát, amely megmutatja az élesztőgomba- és hifaformákat, amelyek oly gyakran láthatók az ilyen típusú mintákban.

Légúti minták
A széklet vizsgálata hasznos ABPA esetén, mivel gyakran láthatók hifák eozinofilekkel és Charcot Leyden-kristályokkal együtt. Alkalmanként nem gyakori gombás fertőzéseket lehet diagnosztizálni mikroszkópos vizsgálattal, amikor gömböcskék vagy nagyméretű élesztőgombák, például Blastomyces dermatitidis láthatóvá válnak. A gombás tracheobronchitisből származó hörgőmosó anyagban Aspergillus vagy más fonalas hifák láthatók, néha sporuláló fejekkel. A mikroszkópos vizsgálat a BAL-mintákból származó invazív tüdőaszpergillózisban nagyobb hozamot ad, mint a tenyésztés, egyes központokban az alkalmazott módszertől függően. Nincs olyan tanulmány, amely összehasonlította volna a mikroszkópos módszereket vagy a gombakultúra hozamát.

Az ABPA-ban szenvedő betegből származó, KOH-val fénymikroszkóposan vizsgált nyálkahártya-dugó, amely az Aspergillusra jellemző hialin elágazó hifák hálózatát mutatja.

Az Aspergillusra jellemző hialinos, szeptáló hifákat mutató BAL-minta azonos preparátuma, balra Blankophorral, jobbra KOH-val festve.

Légúti folyadék KOHH-készítménye, amely széles, nem szeptált hifákat mutat, amelyek Zygomycete-re jellemzőek.

Vérfilm vagy csontvelő

A vérből és csontvelőből végzett mikroszkópos vizsgálat érzékenysége a legtöbb gombás fertőzés esetében nem elég nagy ahhoz, hogy indokolttá tegye a minták vizsgálatára fordított időt, kivéve a disszeminált histoplasmosist és a Penicillium marneffei-t, általában AIDS-ben.

Mycetoma szemcsék

A mycetoma diagnózisa a szemcsék azonosításától függ, amelyeket lehetőleg steril tűvel, nem felszakadt pustulából (sinusból) kell venni. Az elváltozás tetejét le kell emelni, és a sinus tartalmát, beleértve a szemcséket is, ki kell nyomni, és üveglemezre kell helyezni. Minden egyes szemcsét ki kell szedni, 70%-os alkoholban le kell öblíteni, majd steril sóoldatban kell kimosni, mielőtt tenyésztésre kerülne sor. A szemcsék közvetlen mikroszkópos vizsgálata 20%-os kálium-hidroxidban megerősíti a mycetoma diagnózisát, és azt is megmutatja, hogy a kórokozó szervezet gomba vagy aktinomicita. A fekete szemcsék gombafertőzésre utalnak; az apró fehér szemcsék gyakran Nocardia-fertőzésre utalnak, a nagyobb, tűhegynyi méretű fehér szemcsék pedig gombás vagy aktinomikózisos eredetűek lehetnek. Az apró, vörös szemcsék az Actinomadura pelletieri-re jellemzőek, de a sárgásfehér szemcsék actinomycotikus vagy gombás eredetűek is lehetnek. Az aktinomikotikus szemcsék nagyon finom szálakat tartalmaznak (<1 um átmérőjűek), míg a gombaszemcsék rövid, összefonódott hifák tömegeit tartalmazzák (2-4 um átmérőjűek), amelyek néha pigmentáltak.

Denning DW, Evans EGV, Kibbler CC, Richardson MD, Roberts MM, Rogers TR, Warnock DW, Warren RE. Fungal nail disease: a guide to good practice (Report of a Working Group of the British Society for Medical Mycology). Br Med J 1995; 311: 1277-1281.

Monod M, Baudraz-Rosselet F, Ramelet AA, Frenk E. Direct mycological examination in dermatology: a comparison of different methods. Dermatologica. 1989;179(4):183-6. PMID: 2695355

Procop GW, Haddad S, Quinn J, Wilson ML, Henshaw NG, Reller LB, Artymyshyn RL, Katanik MT, Weinstein MP. A Pneumocystis jiroveci kimutatása légúti mintákban négy festési módszerrel. J Clin Microbiol. 2004 Jul;42(7):3333-5. PubMed PMID: 15243109; PubMed Central PMCID: PMC446244.