1.4.3.2 Mosquitoes
Mosquitoes are vectors of serious human diseases such as malaria, dengue fever and yellow fever, and despite efforts to control them, they remain a serious problem. L’identificazione di nuovi geni di zanzara coinvolti nell’olfatto, nell’alimentazione del sangue, nella digestione, nella riproduzione, nell’immunità, ecc., dovrebbe fornire le basi per lo sviluppo di nuovi metodi per controllare le popolazioni di zanzare e le malattie trasmesse dalle zanzare (Chen et al., 2008).
Le recenti informazioni sulla sequenza del genoma di tre importanti vettori di zanzare, Anopheles gambiae, Aedes aegypti, e Culex pipiens quinquefasciatus (http://www.vectorbase.org/), sono state utilizzate per la genomica comparativa e gli studi di profilo trascrizionale che stanno permettendo l’identificazione di grandi serie di nuovi geni di zanzare. RNAi è diventato rapidamente lo strumento di scelta per caratterizzare la funzione genica in diversi campi della biologia delle zanzare e le interazioni zanzara-patogeno (ad esempio Fragkoudis et al., 2009). Questo ha portato alla pubblicazione di abbastanza numerosi saggi funzionali RNAi in questo gruppo di organismi, compresi i membri del aedines (A. aegypti, Armigeres subalbtus e C. pipiens) e anophelines (A. gambiae e Anopheles stephensi). La maggior parte di questi studi, tuttavia, si sono concentrati solo su due specie: il principale vettore di dengue e febbre gialla, A. aegypti, e il vettore africano della malaria, A. gambiae (Tabella 1.1).
In questi studi, la tipica strategia sperimentale prevedeva la microiniezione di dsRNA nel torace delle zanzare adulte seguita da alimentazione, sfida con agenti patogeni, odoranti, insetticidi o condizioni di stress, e il successivo esame delle zanzare per analizzare l’effetto fenotipico del silenziamento del gene target sul processo fisiologico in studio, tra cui olfazione, alimentazione, digestione e metabolismo, stress, detossificazione, formazione della cuticola, riproduzione, immunità e regolazione della diapausa. Di seguito, presentiamo alcuni studi rappresentativi di RNAi nelle zanzare.
L’olfatto media una vasta gamma di comportamenti delle zanzare adulte e larvali, tra cui l’alimentazione, la preferenza dell’ospite, la localizzazione/selezione del compagno e i siti di riproduzione per l’ovodeposizione. L’olfatto comporta la percezione di stimoli chimici forniti da molecole odoranti e lo sviluppo di risposte specifiche a tali stimoli. Gli odoranti sono catturati da proteine leganti gli odoranti (OBP), che li trasportano ai recettori degli odoranti (OR) sulle membrane dendritiche dei neuroni olfattivi. Il recente targeting RNAi dei geni OBP e OR ha fornito preziose informazioni sulla loro funzione nel meccanismo dell’olfatto e sulla specificità (Biessmann et al., 2010; Liu et al., 2010; Pelletier et al, 2010), aprendo l’opportunità di modificare la percezione dell’olfatto e quindi una serie di comportamenti che potrebbero risultare nella prevenzione della puntura e dell’accoppiamento delle zanzare.
Nei climi temperati, le zanzare femmine adulte svernano in diapausa, un periodo di dormienza che è caratterizzato dall’assenza di comportamenti di ricerca dell’ospite, dall’accumulo di enormi riserve di grasso e da un arresto dello sviluppo ovarico. La manipolazione della regolazione di questo episodio di dormienza potrebbe risultare, per esempio, nell’induzione di zanzare dormienti e non in cerca dell’ospite. Questo è stato esemplificato in diversi studi del team del Dr. Denlinger. In particolare, hanno recentemente usato l’RNAi per studiare il meccanismo della diapausa in C. pipiens, per evidenziare la partecipazione della via di segnalazione insulina/FOXO nella regolazione della diapausa (Sim e Denlinger, 2008, 2009a). Hanno anche dimostrato il coinvolgimento di alcune sintasi degli acidi grassi nell’accumulo di riserve di grasso nelle femmine svernanti (Sim e Denlinger, 2009b), e il ruolo delle proteine ribosomiali S3 e S2 nello sviluppo dei follicoli nelle femmine non in diapausa (Kim e Denlinger, 2010; Kim et al., 2010).
Vitellogenesi e riproduzione sono state caratterizzate anche da RNAi nelle zanzare. Simile alla situazione nelle zecche, le zanzare anautogene richiedono l’assunzione di sangue dell’ospite vertebrato per iniziare un ciclo riproduttivo che comporta la produzione di uova. Gli aminoacidi (AA) derivati dal pasto di sangue sono utilizzati dal corpo grasso della zanzara per sintetizzare i precursori delle proteine del tuorlo, principalmente la vitellogenina (Vg), in un processo chiamato vitellogenesi. La Vg viene poi rilasciata nell’emolinfa e assorbita dalle ovaie e depositata negli ovociti in via di sviluppo attraverso uno specifico VgR.
Nella zanzara A. aegypti, l’espressione del gene Vg è stata studiata intensamente dal team del Dr. Raikhel in una lunga serie di eleganti esperimenti, in cui hanno usato l’RNAi come strumento per la genomica funzionale inversa. Questo team ha dimostrato che la trascrizione del gene Vg è strettamente regolata dagli input combinati di diverse molecole, tra cui la cascata dell’ormone steroideo 20-idrossicodisone (20E) e la segnalazione nutrizionale AA/Target-of-Rapamycin (TOR). Questa serina/treonina chinasi è responsabile della trasduzione del segnale AA, attivando la fosforilazione della S6 chinasi che è necessaria per l’attivazione degli eventi traslazionali (Park et al., 2006; Roy e Raikhel, 2011). Inoltre, iniettando un antagomir specifico, lo stesso team ha prodotto una deplezione RNAi-mediata del miRNAi miR-27 per dimostrare la funzione del miR-27 come regolatore positivo sia nella digestione del sangue che nello sviluppo delle uova. Infatti, il miR-27 di per sé è regolato dalle vie 20E e AA/TOR (Bryant et al., 2010).
Il sistema immunitario innato dei vettori di zanzara comprende tre categorie funzionali di geni coinvolti nel riconoscimento dei patogeni, vie di segnalazione che mediano l’amplificazione, la modulazione e la trasduzione del segnale e meccanismi effettori che mediano la rimozione del patogeno dall’ospite (Baton et al., 2008). L’RNAi è esso stesso un importante meccanismo immunitario antivirale nelle zanzare. Nell’immunità antivirale basata sull’RNA, il dsRNA virale viene riconosciuto e trasformato in siRNA dalla zanzara Dicer. Dopo di che, questi siRNA derivati dal virus guidano l’immunità antivirale specifica attraverso l’RNAi e i relativi meccanismi di silenziamento dell’RNA (Ding, 2010). Numerosi articoli riportano l’uso di RNAi per caratterizzare la funzione dei geni immunitari della zanzara. Gli studi sui meccanismi immunitari generali e sugli effettori si sono concentrati sui recettori di riconoscimento del modello, sulle molecole della via di segnalazione antibatterica e antimicotica e sulle proteine coinvolte in altri meccanismi cellulari effettori (rivisti in Dong et al., 2006; Moita et al., 2005; Shin et al., 2003, 2006; Wang et al., 2006).
L’RNAi è stato utilizzato anche nella caratterizzazione dell’interfaccia zanzara-patogeno, molte indagini guardando alle molecole di zanzara legate al sistema immunitario. Le interazioni molecolari all’interfaccia zanzara-patogeno assicurano la sopravvivenza e lo sviluppo sia del patogeno che del vettore. Pertanto, la comprensione delle interazioni molecolari tra gli agenti patogeni e i loro vettori di zanzara è fondamentale per lo sviluppo di nuove misure di controllo. Nell’ultimo decennio, un intenso sforzo di ricerca è stato dispiegato verso l’identificazione e la caratterizzazione funzionale dei geni di zanzara coinvolti nelle risposte immunitarie indotte dal patogeno utilizzando una varietà di approcci tra cui la genomica comparativa, il profilo trascrizionale e l’analisi funzionale basata su RNAi (Baton et al., 2008). Questi sforzi si sono concentrati principalmente su due associazioni zanzara-patogeno, A. gambiae-Plasmodium sp. e A. aegypti-dengue virus 2 (DENV-2). Le risposte immunitarie innate delle zanzare all’infezione da arbovirus sono state esaminate in dettaglio da Fragkoudis et al. (2009), e quelle ai parassiti della malaria sono state recentemente esaminate da Brown e Catteruccia (2006) e Baton et al. (2008), compresi gli approcci RNAi.
La maggior parte di questi studi basati su RNAi hanno preso di mira i geni dei meccanismi di difesa immunitaria delle zanzare piuttosto che i geni necessari ai patogeni per svilupparsi nel vettore zanzara. Per quanto riguarda i geni antimalarici della zanzara sottoposti a RNAi knock-down, la maggior parte di essi sono quelli coinvolti nell’uccisione di ookinete e nella melanizzazione durante la penetrazione nel midgut (rivisto in Brown e Catteruccia, 2006; Baton et al., 2008). Per quanto riguarda i geni antivirali della zanzara sottoposti a knock-down, alcuni sono componenti delle vie di segnalazione, mentre altri fanno parte della difesa antivirale basata su RNAi (rivisto in Fragkoudis et al., 2009).
Tra i lavori più recenti, Guo et al. (2010) presentano un approccio utile per identificare nuove proteine di A. aegypti che interagiscono con DENV-2. Questi autori hanno sviluppato la prima bozza della rete di interazione delle proteine della zanzara usando un approccio computazionale e hanno identificato 714 proteine putative di A. aegypti associate al DENV che si raggruppano in quattro categorie funzionali principali (replicazione/trascrizione/traslazione, immunità, trasporto e metabolismo). Dieci di queste proteine putative associate al DENV sono state selezionate a caso per la convalida mediante silenziamento genico mediato da RNAi, e il titolo virale della dengue nelle budella della zanzara è stato significativamente ridotto per cinque di esse.
Collettivamente, questi risultati supportano l’idea che l’RNAi potrebbe essere un potente strumento per la caratterizzazione high-throughput del sistema immunitario degli insetti vettori di malattie, contribuendo così all’identificazione e alla caratterizzazione di potenziali obiettivi delle zanzare per lo sviluppo di nuovi metodi per controllare le popolazioni di zanzare, i parassiti all’interno delle zanzare e le malattie trasmesse dalle zanzare.
Dopo la scoperta che l’RNAi è una delle principali difese della zanzara contro gli arbovirus, è stato riportato che la soppressione di questa via aumenta la carica virale nelle zanzare infette (Sanchez-Vargas et al, 2009). Cirimotich et al. (2009) hanno usato un virus Sindbis ingegnerizzato per esprimere una proteina che si lega al dsRNA e presumibilmente lo protegge dall’elaborazione nella via RNAi, agendo così come un soppressore RNAi. Questo virus ingegnerizzato produce molte più particelle virali del normale nelle zanzare infette ed è letale per una serie di specie di zanzare (A. aegypti, Aedes albopictus, C. trithaeniorhynchus). Questo approccio è un esempio di nuovo sviluppo basato sulla genetica, potenzialmente utile nelle strategie di “soppressione della popolazione” per il controllo delle zanzare (Alphey, 2009).
È stato sviluppato anche l’obiettivo opposto, cioè il potenziamento artificiale dell’immunità antivirale delle zanzare basato sull’RNAi per ottenere zanzare resistenti al virus. L’RNAi antivirale è stato usato per conferire resistenza al DENV in zanzare A. aegypti transgeniche, esprimendo un RNA forcina corrispondente a un frammento del virus (Franz et al., 2009). Utilizzando promotori specifici per tessuto e tempo, l’espressione dell’RNA a forcina può essere limitata al midgut – le prime cellule ad essere infettate – e solo dopo il pasto di sangue, minimizzando i potenziali problemi di fitness della zanzara derivanti dall’espressione costitutiva di un RNA a forcina lunga. Una discussione sui vantaggi e i problemi dell’uso di questo tipo di ceppi transgenici di zanzare resistenti nelle strategie di “sostituzione della popolazione” per il controllo delle zanzare può essere trovata in Alphey (2009).