De biosyntheseweg van cholesterol is lang en vereist aanzienlijke hoeveelheden reductie- en ATP-energie, vandaar dat hij hier is opgenomen. Cholesterol speelt in het lichaam een belangrijke rol in de membranen. Het is ook een precursor van steroïdhormonen en galzuren en zijn directe metabolische precursor, 7-dehydrocholesterol, is een precursor van vitamine D. De route die naar cholesterol leidt, staat bekend als de isoprenoïdenroute en vertakkingen daarvan leiden naar andere moleculen, waaronder andere in vet oplosbare vitaminen.

Van HMG-CoA katalyseert het enzym HMG-CoA-reductase de vorming van mevalonaat. De reactie vereist NADPH en resulteert in het vrijkomen van co-enzym A en lijkt een van de belangrijkste regulerende stappen in de syntheseweg te zijn. Het enzym wordt gereguleerd zowel door terugkoppeling (cholesterol remt het af) als door covalente modificatie (fosforylering remt het af). De synthese van het enzym wordt ook transcriptioneel geregeld. Wanneer het cholesterolgehalte daalt, neemt de transcriptie van het gen toe.

Mevalonaat wordt tweemaal gefosforyleerd en vervolgens gedecarboxyleerd om het vijf-koolstof tussenproduct te verkrijgen dat bekend staat als isopentenyl-pyrofosfaat (IPP). IPP wordt gemakkelijk omgezet in dimethylallylpyrofosfaat (DMAPP). Deze twee verbindingen van vijf koolstofverbindingen, ook isoprenen genoemd, zijn de bouwstenen voor de synthese van cholesterol en verwante verbindingen. Deze route staat bekend als de isoprenoïdenroute. Hij verloopt in de richting van cholesterol beginnend met de verbinding van IPP en DMAPP om geranyl-pyrofosfaat te vormen. Geranyl-pyrofosfaat verbindt zich met een ander IPP om farnesyl-pyrofosfaat te maken, een 15-koolstofverbinding. Twee farnesyl-pyrofosfaten verbinden zich tot de 30-koolstofverbinding die bekend staat als squaleen. Squaleen vormt in een ingewikkelde herschikking, waarbij reductie en moleculaire zuurstof betrokken zijn, een cyclisch tussenproduct dat lanosterol wordt genoemd en lijkt op cholesterol. De omzetting van lanosterol in cholesterol is een langdurig proces met 19 stappen dat plaatsvindt in het endoplasmatisch reticulum.

Uit cholesterol kan men vitamine D vormen of de steroïdhormonen, waaronder de progestagenen, androgenen, oestrogenen, mineralocorticoïden, en de glucocorticoïden. De vertakkingsmolecule voor al deze hormonen is de cholesterolmetaboliet (en progestageen) die bekend staat als pregnenalone. De progestagenen zijn voorlopers van alle andere klassen.

De oestrogenen worden afgeleid van de androgenen in een interessante reactie die de vorming van een aromatische ring vereist. Het enzym dat deze reactie katalyseert, staat bekend als aromatase en is van medisch belang. De groei van sommige tumoren wordt door oestrogenen gestimuleerd, zodat aromataseremmers worden voorgeschreven om de vorming van oestrogenen te voorkomen en de tumorgroei te vertragen. Opgemerkt zij dat de synthese van andere vetoplosbare vitaminen en chlorofyl zich ook vertakt van de isoprenoïd-syntheseroute bij geranylpyrofosfaat. Het samenvoegen van twee geranylgeranylpyrofosfaten vindt plaats in planten en bacteriën en leidt tot de synthese van lycopeen, dat op zijn beurt een precursor is van bètacaroteen, de uiteindelijke precursor van vitamine A. Vitamines E en K, evenals chlorofyl, worden eveneens gesynthetiseerd uit geranylgeranylpyrofosfaat.