Ammoniumacetaat buffers kunnen verschillende problemen veroorzaken in het lab. Twee veel voorkomende problemen zijn verrassende stijgingen van de HPLC-MS tegendruk bij het opstarten van het instrument na een nacht opslag en moeilijkheden met de MS gevoeligheid.
Verhoogde instrument tegendruk bij gebruik van ammoniumacetaat (en ammoniumformiaat) is een veel voorkomend probleem gevonden op chromatografie forums, vooral wanneer het instrument ‘s nachts stond of op de eerste paar runs van elke dag. Goed oplosbare waterige buffers kunnen tot veel hoofdbrekens leiden. Zij worden problematisch bij praktisch gebruik, blokkeren capillairen, pre-kolommen, en analytische kolom eindfritten.
Deze problemen zijn steevast het gevolg van een verkeerd begrip van de oplosbaarheid van buffers in gemengde organische waterige media. Dit kan worden verholpen met behulp van de gegevens in figuur 1.
Figuur 1: Oplosbaarheid van vijf buffers in mengsels met acetonitril. (Met toestemming overgenomen uit Ref. 1)
Figuur 1 laat duidelijk zien dat de oplosbaarheid van ammoniumacetaat in binaire mengsels die meer dan 90% acetonitril bevatten steeds verder wordt beperkt, en volledig onoplosbaar wordt in 100% acetonitril. Terwijl 20 mM ammoniumacetaat de oplosbaarheidsgrens is bij 90% acetonitril, daalt deze grens scherp tot 10 mM ammoniumacetaat (een populaire bufferconcentratie die bij LC-MS-toepassingen wordt gebruikt) bij 95% acetonitrilmengsels. Overschrijding van deze oplosbaarheidsgrenzen leidt tot een troebele vloeistof als gevolg van het fijne ammoniumacetaatneerslag in de oplossing. Hierdoor kunnen haarvaten en kolomfritten verstopt raken, waardoor de tegendruk in het systeem toeneemt. Ook moet worden opgemerkt dat de gegevens van figuur 1 zijn verkregen met een buffer van hoge kwaliteit – de oplosbaarheid zal afnemen als reagentia met een bufferzout van lagere kwaliteit (zuiverheid) worden gebruikt. Vermijd pogingen om ammoniumacetaat in zuiver acetonitril op te lossen, ook al kan er dan water aan de oplossing worden toegevoegd. Hoewel de buffer aanvankelijk oplosbaar lijkt, zal deze snel uit de oplossing vallen (figuur 2).
Figuur 2: Ammoniumacetaatresidu dat ontstaat bij het “oplossen” van ammoniumacetaat in acetonitril, gevolgd door de toevoeging van water om de vereiste organische/waterige verhouding van het eluent te verkrijgen (Foto met dank aan dr. Paul Ferguson, Astra Zeneca, UK).
In een typische omgekeerde fase HPLC gradiënt is dit misschien niet zo’n probleem, tenzij natuurlijk uw gradiënt naar >90% acetonitril gaat. Er zijn echter andere overwegingen, zoals de relatieve percentages van het organische oplosmiddel de waterige buffer kan tegenkomen bij het mengen met behulp van lage of hoge druk mengsystemen, bij het injecteren van monsters opgelost in hoge percentages acetonitril of, in het ergste van alle gevallen, wanneer systemen worden gespoeld met 100% acetonitril om de kolom verontreinigingen te verwijderen of voor ‘s nachts opslag.
Bij het gebruik van 100% acetonitril voor de opslag van kolommen moet er verder rekening mee worden gehouden dat in 100% organisch oplosmiddel grote pH-verschuivingen kunnen optreden en dat men zich ervan bewust moet zijn of deze pH-verschuivingen de pH-waarde van de kolomopslag kunnen brengen in een gebied waar de oplossing van de silicamatrix mogelijk is, wat kan leiden tot de vorming van “fijne deeltjes” in de kolom die uiteindelijk zullen leiden tot blokkering van de kolom (bij hoge pH) of tot het strippen van de gebonden fase-liganden (bij lage pH).
Ammoniumacetaat als buffer
Velen hebben ervoor gekozen ammoniumacetaat als buffer te gebruiken, vooral wanneer MS-detectie wordt gebruikt, vanwege de inherente vluchtigheid en de geringe neiging tot verontreiniging met API-bronnen. Wees echter bedacht op deze beperkte oplosbaarheid en pas onze HPLC-praktijk dienovereenkomstig aan. Begrijp of het gebruik van ammoniumacetaat geschikt is voor het experiment en of een buffer werkelijk nodig is. De vereisten voor het gebruik en de juiste keuze en concentratie van een buffer worden vaak verkeerd begrepen. Ammoniumacetaat is het geval bij uitstek om het gebruik en misbruik van dit geliefde buffersysteem te onderzoeken.
Buffers zijn nodig om weerstand te bieden aan kleine veranderingen in pH (voornamelijk van het eluent) en om ervoor te zorgen dat de HPLC-kolom in een toestand van constante lading blijft (voornamelijk de ionisatietoestand van resterende silanolsoorten op het oppervlak van de silica-ondersteuning). Veranderingen in de pH kunnen problemen veroorzaken met de stabiliteit van de retentietijd, de piekvorm en (bij gebruik van Electrospray MS) de gevoeligheid van het instrument. Gewoonlijk zal de grootste “uitdaging” voor de pH van het systeem komen van het mengen van de monsterverdunner met het eluent in de verbindingscomponenten tussen de injector en de HPLC-kolom (of pre-kolom) en aan de kop van de kolom. Indien de pH van de monsterverdunner verschilt, kan de ionisatiestatus van de analyt (of een deel van de analytmoleculen) veranderen en kan de chromatografie of de respons in de MS-interface daardoor anders zijn. Inzicht in de chemie van onze analysemethode is echter belangrijk om kritische keuzes te kunnen maken voor het type en de concentratie van de buffer. De analytconcentraties en de hoeveelheid kolomoppervlak waarvoor pH-regeling nodig is, zijn laag genoeg om slechts een zeer lage concentratie buffer nodig te hebben om reproduceerbare retentietijden, een aanvaardbare piekvorm en detectiegevoeligheid te behouden.
Figuur 3 geeft de situaties aan waarin ammoniumacetaat zowel bij chromatografie als bij massaspectrometrie van nut kan zijn.
Figuur 3: Variatie van de buffercapaciteit voor een waterige ammoniumacetaatoplossing (10 mM) met verschillende verhoudingen acetonitril (%) (Aangepast met toestemming van Ref. 2)
Essentieel zijn er twee buffergebieden wanneer 10mM ammoniumacetaat wordt toegevoegd aan onze eluentoplossing, en ofwel verdunde ammoniak of mierenzuur worden gebruikt om de pH aan te passen. Zonder de toevoeging van het zuur of de base zal de oplossing zeer weinig buffercapaciteit hebben.
In 100% waterige oplossing liggen de buffer pKa-waarden rond 4,8 en 9,5. De buffer wordt het best gebruikt rond +/- 1 pH-eenheid van de buffer pKa, waar de buffercapaciteit zal worden verminderd tot ongeveer 66%. Op 2 pH-eenheden afstand van de buffer pKa, vermindert de buffercapaciteit tot ongeveer 5%. Voor een ammoniumacetaatbuffer in water dient de pH van het eluent dat voor de scheiding wordt gebruikt 3,8 tot 5,8 te bedragen wanneer mierenzuur als pH-wijziger wordt gebruikt, en 8,5 tot 10,5 wanneer ammoniak wordt gebruikt om de pH van het eluent aan te passen. Het voorbehoud: zodra acetonitril aan het systeem wordt toegevoegd, verandert dit werkbereik en wordt het bruikbare pH-bereik 5,2 tot 7,2 of 7,9 tot 9,9 bij 60% acetonitril. Voor gradiëntscheidingen zal de pKa van het buffersysteem voortdurend veranderen. De pKa van het systeem bij de begincompositie van de gradiënt wordt gebruikt om de bruikbaarheid van de buffer voor de scheiding in te schatten.
Zijn deze pH-bereiken voldoende om veranderingen in de mate van ionisatie van de analyt of veranderingen in de protonatie van de kolom te voorkomen? Dat is de hamvraag.
Voor MS-detectie zullen ionogene analyten in geïoniseerde vorm resulteren in een goede detectiegevoeligheid, terwijl de reversed phase-retentie wordt beheerst door een oordeelkundige keuze van stationaire fase en organisch oplosmiddeltype en -samenstelling. Als de analyt bij de hierboven (en in figuur 3) aangegeven pH-waarden volledig geïoniseerd is, zullen de chromatografische en detectieprestaties goed zijn. Uit figuur 1 blijkt dat de buffercapaciteit van het systeem afneemt naarmate acetonitril wordt toegevoegd, waarbij de buffercapaciteit daalt tot 30% van de waterige waarde bij 60% acetonitril. Het belangrijkste principe bij het gebruik van buffers in LC-MS is zo weinig mogelijk te gebruiken om de reproduceerbaarheid van de retentietijd, een aanvaardbare piekvorm en de gevoeligheid van de detector te handhaven. De concentratie van de buffer is rechtstreeks van invloed op de hoeveelheid ionenonderdrukking die optreedt en daardoor ook op de gevoeligheid van de methode. Om bij lagere bufferconcentraties een goede buffercapaciteit te behouden, wordt er vaak naar gestreefd binnen +/- 0,5 eenheden van de pKa van de buffer te werken.
Tabel 1 geeft de aanbevolen pH-bereiken waarin ammoniumacetaatbuffers bruikbaar zullen zijn.
| % MeCN | Maximale buffercapaciteit (azijnzuur / acetaat) | Maximale buffercapaciteit (ammonium / ammoniak) | Buffercapaciteit (% ten opzichte van 100% Aq oplossing) |
| 0 | 4.2 – 5.2 | 9.0 – 10.0 | 100 |
| 20 | 4.7 – 5.7 | 8.7 – 9.7 | 80 |
| 40 | 5.0 – 6.0 | 8.5 – 9.5 | 50 |
| 60 | 5.6 – 6.6 | 8.3 – 9.3 | 30 |
Tabel 1: Aanbevolen pH-werkbereiken en indicatieve relatieve buffercapaciteiten voor 0,1mM ammoniumacetaat (aq) / acetonitril eluentsystemen.
Gebruik de buffercapaciteiten uit tabel 1 om de pH van het eluent te kiezen waarbij de analyt voor 100% moet worden geïoniseerd. Merk op dat de bufferconcentratie die wordt gebruikt om deze cijfers af te leiden 0,1mM is – een populaire keuze voor bufferconcentratie bij gebruik van MS-detectie. Voor basische analyten is het azijnzuur/acetaat-buffersysteem gebruikelijk en de pH van het eluent ligt gewoonlijk ruim onder de pKa van de basische analyten, zodat deze voortdurend worden geprotoneerd. Hetzelfde geldt voor zure analyten met het ammonium/ammoniaksysteem, waarbij alle zure analyten volledig moeten worden gedeprotoneerd. Dit zorgt voor stabiele retentietijden, gezonde piekvormen en een optimale gevoeligheid van de MS vanuit het oogpunt van de chemie van de methode.
Er zijn grote leemten in de effectieve bufferingsbereiken voor eluenten op basis van ammoniumacetaat. Dat wil zeggen, bij een eluentsamenstelling van 20% acetrontril (of een uitgangsgradiëntsamenstelling van 20% acetonitril) is er waarschijnlijk een lagere buffercapaciteit (er zullen hogere bufferconcentraties moeten worden gebruikt) bij een eluent-pH lager dan 4,2, tussen pH 5,2 en 9,0 of hoger dan 10,0. Er zijn andere methoden waarbij de pH van het eluent buiten deze aanbevolen bereiken wordt aangepast wanneer ammoniumacetaatbuffers worden gebruikt. Overweeg het gebruik van een ander buffersysteem – het mierenzuursysteem is een populaire keuze bij pH-waarden van het eluent lager dan 4,2.
Moet er altijd een buffer worden gebruikt?
Als de pH van het eluent ver van de pKa van de analyt ligt, zullen kleine veranderingen in de pH van het eluent een te verwaarlozen effect hebben op de ionisatiegraad van de analyt. Onder deze omstandigheden kan het gebruik van een buffer onnodig zijn. Azijnzuur (en ook mierenzuur, trifluoro- en difluorazijnzuur) hebben bijvoorbeeld een aanzienlijke “zelfbuffercapaciteit” bij lage pH en zorgen voor een basische pKa van de analyt >2 pH-eenheden hoger en een zure pKa
Hierbij wordt ervan uitgegaan dat basische analyten worden geanalyseerd met een zuur eluentsysteem en zure analyten met een meer basische pH van het eluentsysteem om volledige ionisatie en een goede gevoeligheid van electrospray MS te waarborgen. Indien er problemen zijn met de tegendruk van het instrument, de instabiliteit van de retentietijd of de gevoeligheid van de MS-detectie, kan het de moeite lonen te overwegen of een bufferzout al dan niet nodig is. Het oordeelkundig gebruik van mierenzuur, azijnzuur of ammoniakoplossing kan eventuele problemen oplossen.
Hoe dan ook, neem de tijd om de chemie van de methode te begrijpen met betrekking tot de pKa van uw analyt, de vereiste pH van het eluent en de keuze van het buffersysteem dat wordt gebruikt om deze pH in het systeem te bereiken en te handhaven.
Voor degenen die geen pKa-informatie over de analyt hebben, zijn er een aantal gratis programma’s beschikbaar die redelijk goed werk leveren met het voorspellen van de pKa van de analyt op basis van de structuur. Veel gebruikte programma’s in onze laboratoria zijn:
- ChemSketch – https://www.acdlabs.com/resources/freeware/chemsketch/
- MarvinSketch – https://chemaxon.com/products/marvin
Als u meer wilt weten over buffers en hun gebruik binnen HPLC en LC-MS, raadpleeg dan de artikelen in referenties 3-6.
Solubility of Buffers in Aqueous-Organic Eluents for Reversed-Phase Liquid Chromatography, Adam P. Schellinger and Peter W. Carr, LCGC North America Volume 22 Number 6 June 2004
Bufferoverwegingen voor LC en LC-MS, Xavier Subirats, Elisabeth Bosch, and Marti Rosés, LCGC North America Volume 27 Number 11 November 2009
Mobile-Phase Buffers, Deel I – De Interpretatie van pH in Gedeeltelijk Waterige Mobiele Fasen, LCGC North America Volume 20 Nummer 11 November 2002
Mobile-Phase Buffers, Deel II – Buffer Selectie en Capaciteit, LCGC North America Volume 20 Nummer 12 December 2002
Mobile-Phase Buffers, Deel III – Buffer Selectie en Capaciteit, LCGC North America Volume 21 Nummer 1 Januari 2003
Mobile Phase Buffers in LC: Effect of Buffer Preparation Method on Retention Repeatability, LCGC North America Volume 37, Issue 7, July 2019