3.1 Endogene Enzymen in vis
Zoals hierboven besproken, worden in de ingewanden, het spijsverteringskanaal en het spierweefsel van vis diverse proteolytische enzymen aangetroffen.
De belangrijkste endogene proteïnasen in ansjovis waren trypsine-achtige proteïnase, pepsine, chymotrypsine, elastase, en aminopeptidase (Martinez & Serra, 1989; Siringan, Raksakulthai, & Yongsawatdigul, 2006). De spijsverteringsenzymen trypsine, chymotrypsine en pepsine worden beschouwd als de drie belangrijkste enzymen in vergelijking met de andere (de la Parra, Rosas, Lazo, & Viana, 2007). Pepsine wordt meestal aangetroffen in de maag van vissen en is een hoofdenzym van de spijsverteringssappen (de la Parra et al., 2007). Trypsine is aanwezig in ingewanden, pylorische caeca, en milt (Kishimura, Hayashi, Miyashita, & Nonami, 2005, 2006; Kishimura et al., 2007; Klomklao et al., 2006). De hepatopancreas van de spijsverteringsorganen van vis en schaaldieren bevat zowel peptidase- als proteïnase-activiteiten, zoals aminopeptidase, gelatinolytische proteasen, trypsine en chymotrypsine, en collagenolytische proteasen (Sriket, 2014).
Het bleek dat de meeste lipolyse- en proteolyse-activiteiten bij de verwerking van peda in de darm werden geregistreerd, vooral aan het begin van het fermentatieproces; de activiteiten namen echter snel af tijdens het proces (Irianto, 1990). Aangezien enzymen in de ingewanden en het spijsverteringskanaal worden aangetroffen, speelt het verwijderen van de ingewanden een belangrijke rol bij het bepalen van de snelheid en het type van enzymatische afbraak die plaatsvindt. Gefermenteerde visproducten die met de hele vis zijn verwerkt, zullen andere kenmerken hebben dan die welke zijn vervaardigd met vis zonder kop en ingewanden (Wheaton & Lawson, 1985). De enzymatische activiteit van de meeste vis en spijsverteringskanaal enzymen van vis had de grootste activiteit bij bijna neutrale pH waarden (Bougatef et al., 2007; Munilla-Moran & Saborido-Rey, 1996).
Castillo-Yañez, Pacheco-Aguilar, Garcia-Carreño, and Toro (2004) isoleerden een zuur proteolytisch enzym, dat behoort tot de asparagine protease klasse uit de ingewanden van sardines. Het enzym is vergelijkbaar met pepsine II van andere vissoorten en is stabiel bij pH 3-6 en 45°C.
De pylorische caeca zijn de organen die de belangrijkste bron zijn van alkalische proteïnasen. Een trypsine-achtig enzym verkregen uit de pylorische caeca van kabeljauw (G. morhua) had een isoelectrisch punt van 5,30 en 5,89 en was zeer vergelijkbaar in aminozuursamenstelling met runder trypsine, maar verschilde in het hebben van een hogere relatieve hoeveelheid zure aminozuren en een lagere hoeveelheid basische aminozuren. Het enzym hydrolyseerde ook viseiwitsubstraten (Beirão, Mackie, Teixeira, & Damian, 2001).
Drie alkalische proteïnasen en twee zure proteïnasen werden geïsoleerd uit sardine. Elk van de alkalische proteïnasen hydrolyseerde caseïne sneller dan andere proteïnen. Een belangrijke alkalische proteïnase (III) hydrolyseerde sarcoplasmatische proteïnen van sardine vijf maal sneller dan andere alkalische proteïnases. Elk van de twee zure proteïnasen hydrolyseerde hemoglobine en myoglobine sneller dan de andere proteïnen. Na preïncubatie met 25% NaCl waren een alkalische proteïnase (III) en een zure proteïnase (II) stabiel, terwijl de andere proteïnases onstabiel werden. De twee proteïnasen, alkalische proteïnase III en zure proteïnase II, waren ook stabiel gedurende 3 maanden na het begin van de vissausproductie. De proteolytische activiteit van elk van de alkalische en de zure proteïnasen werd sterk geremd door meer dan 15% NaCl; minimale remming werd echter waargenomen wanneer sardine spierproteïnen als substraat werden gebruikt (Noda, Van, Kusakabe, & Murakami, 1982).
Twee aminopeptidasen (I en II) werden geëxtraheerd uit ontvette inwendige organen van sardine en gezuiverd met behulp van DEAE-cellulosechromatografie, gelfiltratie op Sephadex G-200, en isoelectric focussing. De uiteindelijke preparaten van enzymen I en II werden bij polyacrylamidegelelektroforese vrijwel homogeen bevonden. Het molecuulgewicht van enzymen I en II werd bij gelfiltratie bepaald op respectievelijk 370.000 en 320.000. De iso-elektrische punten waren 4,1 (I) en 4,8 (II), respectievelijk. Beide enzymen werden geremd door EDTA en geactiveerd door Co++. Bestatine kon enzym I remmen, maar enzym II niet. Enzymen I en II hydrolyseerden snel niet alleen synthetische substraten die alanine of leucine bevatten, maar ook di-, tri-, en tetra-alanine. Op basis van al deze kenmerken lijken de sardine-aminopeptidasen op het menselijke alanineaminopeptidase. Enzym I behield meer dan 70% van zijn oorspronkelijke activiteit in 15% NaCl, wat suggereert dat het enzym deelneemt aan het hydrolyseren van viseiwitten en peptiden tijdens de productie van vissaus (Vo Van, Kusakabe, & Murakami, 1983).
De activiteiten van alkalische en zure proteïnases werden vergeleken met runder trypsine en pepsine en toonden aan dat net als runder trypsine de alkalische proteïnase van sardines pyloric caeca caseïne effectiever hydrolyseerde dan andere eiwitsubstraten (Noda et al., 1982).
Spierweefselenzymen, met name kathepsines, peptidasen, transaminases, amidases, aminozuurdecarboxylases, glutamine dehydrogenases, en verwante enzymen, worden allemaal gevonden in het spierweefsel van vissen (Chaveesuk, 1991), en deze enzymen, met name trypsine, chymotrypsine, en kathepsine, zijn betrokken bij de eiwithydrolyse tijdens de fermentatie van vissaus (Fernandes, 2016). Enzymen voor spierweefsel bevinden zich meestal in de cellen. Verteringsenzymen daarentegen zijn exocellulaire secreties. Hoewel sommige studies aantoonden dat spierweefselenzymen een optimale activiteit hebben bij neutrale pH, informeren de meeste rapporten dat lage pH-waarden de spierweefselenzymactiviteit versnellen. De meeste gefermenteerde visproducten worden verwerkt bij een pH van meer dan 4, met uitzondering van viskuilvoer en sommige gefermenteerde visproducten. De meeste spierweefselsenzymen hebben dus eigenlijk geen optimale pH-waarde (Mackie et al., 1971).
Partiële karakterisering van cathepsines B uit de spier van horsmakreel gaf vergelijkbare kenmerken aan met andere cathepsine BS. De optimale pH van de cathepsine was 5 met een optimale temperatuur van 50°C. De activiteit werd geremd door E-64, CA-074, en chymostatine (Yoshida et al., 2015).
Maximale enzymactiviteit kan worden bereikt door hele vissen te gebruiken, inclusief koppen en ingewanden. Integendeel, minimale enzymactiviteit zal optreden wanneer ontkopte en van ingewanden ontdane vis wordt gebruikt voor de productie van gefermenteerde visproducten. Ondertussen kan een intermediaire enzymactiviteit worden verkregen door het verwijderen van de ingewanden op elk moment na de vangst van de vis om enige diffusie van viscerale enzymen in de weefsels mogelijk te maken (Owens & Mendoza, 1985).
In gezouten vis, wordt de rijping beschreven door drie hypothesen. Dit zijn (1) de microbiologische theorie, (2) de autolytische theorie, en (3) de enzymen theorie. In de microbiologische theorie produceren de micro-organismen de essentiële actieve enzymen, en deze enzymen dringen door in het vlees en dragen bij tot het rijpingsproces. De autolytische theorie beschrijft dat de rijping het gevolg is van de activiteit van enzymen van de spieren of andere weefsels, of van het maagdarmkanaal. De enzymtheorie tenslotte verklaart dat het rijpen van gezouten vis plaatsvindt onder invloed van bepaalde enzymen, namelijk die welke zich in het spierweefsel bevinden, die welke zich in de darmorganen van de vis bevinden, samen met die welke door micro-organismen worden geproduceerd (Mackie et al., 1971).
Bij het rijpen van ansjovis werd de maximale autolytische activiteit van Indische ansjovis (Stolephorus indicus) gevonden bij 60°C. De autolytische activiteit nam af met toenemende NaCl-concentratie. Het ruw extract vertoonde een optimale pH bij 8,5-9,5. Trypsine-achtige proteïnasen waren de overheersende proteïnasen in het ruwe extract. Proteïnasen van Indische ansjovis zouden kunnen deelnemen aan de eiwithydrolyse tijdens de fermentatie van vissaus. Daarom zou incubatie van Indische ansjovis bij 60°C en in 10% NaCl gedurende een bepaalde tijd, voordat het volledig wordt gezouten met 25% NaCl, een effectieve manier kunnen zijn om het fermentatieproces van vissaus te versnellen (Siringan et al., 2006).