AFLATOXINS : Occurrence and Health Risks

Aflatoxines zijn toxische metabolieten die door bepaalde schimmels in/op levensmiddelen en diervoeders worden geproduceerd. Het zijn waarschijnlijk de bekendste en meest intensief onderzochte mycotoxinen ter wereld. Aflatoxinen zijn in verband gebracht met verschillende ziekten, zoals aflatoxicose, bij vee, huisdieren en mensen over de hele wereld. Het voorkomen van aflatoxinen wordt beïnvloed door bepaalde milieufactoren; de mate van besmetting zal dus variëren naargelang van de geografische ligging, de landbouw- en agronomische praktijken, en de gevoeligheid van de producten voor schimmelinvasie tijdens de periode vóór de oogst, de opslag en/of de verwerking. Aflatoxinen hebben meer aandacht gekregen dan enig ander mycotoxine vanwege hun bewezen potentiële carcinogene werking bij gevoelige laboratoriumdieren en hun acute toxicologische effecten bij de mens. Aangezien men zich realiseert dat absolute veiligheid nooit bereikt wordt, hebben veel landen geprobeerd de blootstelling aan aflatoxinen te beperken door wettelijke beperkingen op te leggen aan producten die bedoeld zijn voor gebruik als voedsel en veevoer.

Inleiding

In 1960 stierven meer dan 100.000 jonge kalkoenen op pluimveebedrijven in Engeland in de loop van een paar maanden aan een schijnbaar nieuwe ziekte die de naam “Turkey X disease” kreeg. Al snel bleek dat het probleem niet beperkt was tot kalkoenen. Ook eendenkuikens en jonge fazanten werden getroffen en er werd een zware sterfte vastgesteld.

Een zorgvuldig onderzoek van de vroege uitbraken toonde aan dat zij allen in verband werden gebracht met voeder, namelijk Braziliaans pindameel. Een intensief onderzoek van het verdachte pindameel werd ondernomen en al snel werd vastgesteld dat dit pindameel zeer giftig was voor pluimvee en eendenkuikens, met symptomen die typerend zijn voor de ziekte van Turkey X.

Speculaties die in 1960 werden gemaakt over de aard van het toxine, suggereerden dat het van schimmeloorsprong zou kunnen zijn. In feite werd de toxineproducerende schimmel geïdentificeerd als Aspergillus flavus (1961) en kreeg het toxine de naam Aflatoxine op grond van zijn oorsprong (A.flavis–>Afla).

Deze ontdekking heeft geleid tot een groeiend besef van de potentiële gevaren van deze stoffen als contaminanten van voedsel en veevoer die ziekte en zelfs de dood veroorzaken bij de mens en andere zoogdieren. Studies die in de volgende paragrafen zijn samengevat, hebben aangetoond dat aflatoxines voornamelijk worden geproduceerd door sommige stammen van A. Flavus en door de meeste, zo niet alle, stammen van A. parasiticus , plus verwante soorten, A. nomius en A.niger. Bovendien bleek uit deze studies dat er vier belangrijke aflatoxines zijn: B1, B2, G1, G2 plus twee bijkomende stofwisselingsproducten, M1 en M2, die van belang zijn als directe contaminanten van voedsel en veevoeder. De aflatoxinen M1 en M2 werden voor het eerst geïsoleerd uit melk van zogende dieren die met aflatoxinepreparaten werden gevoederd; vandaar de M-benaming. De B-benaming van de aflatoxinen B1 en B2 is het gevolg van de blauwe fluorescentie onder UV-licht, terwijl de G-benaming verwijst naar de geelgroene fluorescentie van de desbetreffende structuren onder UV-licht. Deze toxinen hebben een sterk gelijkende structuur en vormen een unieke groep van sterk geoxygeneerde, natuurlijk voorkomende terocyclische verbindingen. Hun moleculaire formules, zoals vastgesteld aan de hand van elementaire analyses en massaspectrometrische bepalingen, zijn:

• B1 : C17 H12 O6
• B2 : C17 H14 O6
• G1 : C17 H12 O7
• G2 : C17 H14 O7

Aflatoxinen B2 en G2 werden vastgesteld als de dihydroxy-derivaten van respectievelijk B1 en G1. Aflatoxine M1 is 4-hydroxy-aflatoxine B1 en aflatoxine M2 is 4-dihydroxy-aflatoxine B2.

Voorkomen

In rauwe landbouwproducten :

Aflatoxinen komen vaak voor in gewassen op het veld vóór de oogst. Besmetting na de oogst kan optreden als het gewas te laat wordt gedroogd en tijdens de opslag van het gewas als het water de kritische waarden voor de schimmelgroei overschrijdt. Insecten en knaagdieren vergemakkelijken het binnendringen van schimmels in sommige opgeslagen producten.

Aflatoxinen worden af en toe aangetroffen in melk, kaas, maïs, pinda’s, katoenzaad, noten, amandelen, vijgen, specerijen en een groot aantal andere voedingsmiddelen en diervoeders. Melk, eieren en vleesproducten zijn soms besmet als gevolg van de consumptie door dieren van met aflatoxine besmet voeder. De grondstoffen met het hoogste risico van aflatoxinebesmetting zijn echter maïs, pinda’s en katoenzaad.

In verwerkte voedingsmiddelen :

maïs is waarschijnlijk het product dat wereldwijd de meeste zorgen baart, omdat het wordt verbouwd in klimaten waar de kans op aflatoxinebesmetting groot is, en omdat maïs in veel landen het hoofdvoedsel is. De procedures die bij de verwerking van maïs worden toegepast, helpen echter de besmetting van het resulterende voedselproduct te verminderen. Hoewel aflatoxinen in de meeste levensmiddelenprocessen stabiel tot matig stabiel zijn, zijn zij onstabiel in processen zoals die voor de vervaardiging van tortilla’s, waarbij gebruik wordt gemaakt van alkalische omstandigheden of oxiderende stappen. Met aflatoxine verontreinigde maïs en katoenzaadmeel in melkrantsoenen hebben geleid tot met aflatoxine M1 verontreinigde melk en melkproducten, waaronder niet-vette droge melk, kaas en yoghurt.

Factoren die de productie van aflatoxine bevorderen

Schimmelgroei en aflatoxinebesmetting zijn het gevolg van interacties tussen de schimmel, de gastheer en de omgeving. De juiste combinatie van deze factoren bepaalt de aantasting en kolonisatie van het substraat, en het type en de hoeveelheid aflatoxine die wordt geproduceerd. Een geschikt substraat is echter noodzakelijk voor de groei van de schimmel en de daaropvolgende toxineproductie, hoewel de precieze factor(en) die de toxinevorming in gang zet (zetten) nog niet goed bekend is (zijn). Waterstress, stress bij hoge temperaturen en schade door insecten aan de waardplant zijn belangrijke bepalende factoren voor de schimmelaantasting en de toxineproductie. Evenzo zijn specifieke gewasgroeistadia, slechte vruchtbaarheid, hoge gewasdichtheden en onkruidconcurrentie in verband gebracht met een verhoogde schimmelgroei en toxineproductie. De vorming van aflatoxine wordt ook beïnvloed door de groei van andere schimmels of microben. Zo wordt de aflatoxinebesmetting van pinda’s en maïs vóór de oogst bevorderd door hoge temperaturen, langdurige droogte en een hoge insectenactiviteit, terwijl de aflatoxinevorming na de oogst van maïs en pinda’s wordt bevorderd door warme temperaturen en een hoge luchtvochtigheid.

Aflatoxicosis and Animal Health

Aflatoxicose is in de eerste plaats een leveraandoening. De gevoeligheid van individuele dieren voor aflatoxinen varieert aanzienlijk, afhankelijk van soort, leeftijd, geslacht en voeding. Aflatoxinen veroorzaken schade aan de lever, een verminderde melk- en eiproductie, terugkerende infecties als gevolg van onderdrukking van de immuniteit (b.v. salmonellose), naast embryotoxiciteit bij dieren die lage voedingsconcentraties krijgen toegediend. Hoewel de jongen van een soort het meest vatbaar zijn, worden alle leeftijden aangetast, zij het in verschillende mate voor verschillende soorten. Klinische verschijnselen van aflatoxicose bij dieren zijn onder meer maagdarmstoornissen, verminderde voortplanting, verminderde voederbenutting en -efficiëntie, bloedarmoede en geelzucht. Zogende dieren kunnen worden getroffen als gevolg van de omzetting van aflatoxine B1 in het metaboliet aflatoxine M1, dat in melk van melkvee wordt uitgescheiden.

De inductie van kanker door aflatoxinen is uitvoerig bestudeerd. Aangetoond is dat aflatoxine B1, aflatoxine M1 en aflatoxine G1 verschillende soorten kanker veroorzaken bij verschillende diersoorten. Het Internationaal Instituut voor Kankeronderzoek (IARC) is echter van mening dat alleen aflatoxine B1 voldoende bewijs van carcinogeniteit bij proefdieren heeft opgeleverd om als carcinogeen te worden aangemerkt.

Aflatoxinen en menselijke gezondheid

Mensen worden blootgesteld aan aflatoxinen door het consumeren van voedsel dat besmet is met producten van schimmelgroei. Deze blootstelling is moeilijk te vermijden omdat schimmelgroei in voedsel niet gemakkelijk te voorkomen is. Hoewel zwaar besmet voedsel in de ontwikkelde landen niet op de markt mag worden gebracht, blijft men zich zorgen maken over de mogelijke nadelige gevolgen van langdurige blootstelling aan lage concentraties aflatoxinen in de voedselvoorziening.
Er zijn gevallen van acute aflatoxicose bij mensen gerapporteerd uit vele delen van de wereld, met name uit derdewereldlanden zoals Taiwan, Ouganda, India en vele andere. Het syndroom wordt gekenmerkt door braken, buikpijn, longoedeem, stuiptrekkingen, coma, en dood met hersenoedeem en vettige betrokkenheid van de lever, nieren en het hart.

Voorwaarden die de waarschijnlijkheid van acute aflatoxicose bij de mens verhogen, zijn onder meer een beperkte beschikbaarheid van voedsel, milieuomstandigheden die de ontwikkeling van schimmels in gewassen en basisproducten bevorderen, en het ontbreken van regelgevende systemen voor het toezicht op en de controle van aflatoxinen.

Omdat aflatoxinen, vooral aflatoxine B1, bij sommige dieren krachtige carcinogenen zijn, bestaat er belangstelling voor de effecten van langdurige blootstelling aan lage concentraties van deze belangrijke mycotoxinen op de mens. In 1988 plaatste het IARC aflatoxine B1 op de lijst van carcinogenen voor de mens. Dit wordt ondersteund door een aantal epidemiologische studies in Azië en Afrika die een positief verband hebben aangetoond tussen aflatoxinen in de voeding en levercelkanker (LCC). Bovendien kan de expressie van aan aflatoxine gerelateerde ziekten bij mensen worden beïnvloed door factoren zoals leeftijd, geslacht, voedingstoestand, en/of gelijktijdige blootstelling aan andere veroorzakers zoals virale hepatitis (HBV) of aantasting door parasieten.

Recente analysemethoden voor aflatoxinen in voedingsmiddelen en veevoer

Bemonstering en monstervoorbereiding :

Bemonstering en monstervoorbereiding blijven een aanzienlijke bron van fouten bij de analytische identificatie van aflatoxinen. Daarom is een systematische aanpak van de bemonstering, monstervoorbereiding en analyse absoluut noodzakelijk om aflatoxinen op het niveau van deeltjes per miljard te bepalen. In dit verband zijn voor sommige producten, zoals maïs, pinda’s en noten, specifieke plannen ontwikkeld en grondig getest; de bemonsteringsplannen voor sommige andere producten zijn naar deze plannen gemodelleerd. Een gemeenschappelijk kenmerk van alle bemonsteringsplannen is dat het gehele primaire monster moet worden vermalen en gemengd, zodat het analysegedeelte dezelfde toxineconcentratie heeft als het oorspronkelijke monster.

Solid-Phase Extraction :

Alle analyseprocedures omvatten drie stappen: extractie, zuivering, en bepaling. De meest significante recente verbetering in de zuiveringsstap is het gebruik van vastefase-extractie.
Testextracten worden vóór de instrumentele analyse (dunnelaag- of vloeistofchromatografie) opgeschoond om medegeëxtraheerde materialen te verwijderen die vaak interfereren met de bepaling van de doelanalyten.

Dunnelaagchromatografie :

Dunnelaagchromatografie (TLC), ook bekend als flatbedchromatografie of planaire chromatografie, is een van de meest gebruikte scheidingstechnieken bij de analyse van aflatoxinen. Sinds 1990 wordt deze methode beschouwd als de officiële methode van de AOAC en is zij de methode bij uitstek om aflatoxinen te identificeren en te kwantificeren op niveaus van slechts 1 ng/g. De TLC-methode wordt ook gebruikt om bevindingen met nieuwere, snellere technieken te verifiëren.

Liquid Chromatography :

Liquid chromatography (LC) is vergelijkbaar met TLC in vele opzichten, met inbegrip van analyt toepassing, stationaire fase, en mobiele fase. Vloeistofchromatografie en TLC vullen elkaar aan. Het is niet ongebruikelijk dat een analist TLC gebruikt als voorwerk om de LC scheidingscondities te optimaliseren.
vloeistofchromatografiemethoden voor de bepaling van aflatoxinen in levensmiddelen omvatten normale-fase LC (NPLC), reversed-phase LC (RPLC) met pre- of voor-columnderivatisering (BCD), RPLC gevolgd door postcolumnderivatisering (PCD), en RPLC met elektrochemische detectie.

Immunochemische Methoden :

Dunnelaagchromatografie en LC-methoden voor het bepalen van aflatoxinen in levensmiddelen zijn bewerkelijk en tijdrovend. Vaak vereisen deze technieken kennis van en ervaring met chromatografische technieken om seperatie- en interferentieproblemen op te lossen. Dankzij de vooruitgang in de biotechnologie zijn er nu zeer specifieke tests op basis van antilichamen in de handel verkrijgbaar waarmee aflatoxinen in levensmiddelen in minder dan 10 minuten kunnen worden geïdentificeerd en gemeten. Deze tests zijn gebaseerd op de affiniteit van de monoklonale of polyklonale antilichamen voor aflatoxinen. De drie soorten immunochemische methoden zijn radio-immunoassay (RIA), enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA), en immunoaffinity columnassay (ICA).

Bevestiging van de identiteit van de aflatoxinen:

Hoewel analysemethoden kunnen bestaan uit verschillende extractie-, opschonings-, en kwantificeringsstappen, zouden de resultaten van de analyses met dergelijke methoden vergelijkbaar moeten zijn wanneer de methoden juist worden toegepast. Aangezien de betrouwbaarheid van de kwantitatieve gegevens niet ter discussie staat, is het probleem dat nog moet worden opgelost de bevestiging van de identiteit van de aflatoxinen. De gebruikte bevestigingstechnieken zijn chemische derivatisering of massaspectrometrie (MS).

Veiligheidskwesties bij de behandeling van beschimmelde granen en aflatoxinen :

Veiligheid is een sleutelkwestie voor wetenschappers die werkzaam zijn op het gebied van aflatoxinen. Er moeten maatregelen worden genomen om de blootstelling aan de toxinen en aan de producerende micro-organismen, Aspergillus flavus en Aspergillusparasiticus, tot een minimum te beperken. Er moet een veiligheidsprogramma worden opgesteld dat voldoet aan de eisen van de Laboratoriumnorm van de Occupational Safety and Health Administration (1990) en de richtlijnen van de National Institutes of Health (1981) betreffende het gebruik van chemische carcinogenen.

Monitoring Techniques for Assessing Human Exposure to Aflatoxins

In the last few years, new technologies have been developed that more accurately monitor individual exposures to aflatoxins. Bijzondere aandacht is besteed aan de analyse van aflatoxine DNA-adducten en albumine-adducten als surrogaten voor genotoxiciteit bij mensen. Autrup et al. (1983) waren pioniers in het gebruik van synchrone fluorescentiespectroscopie voor de meting van DNA-adducten van aflatoxinen in urine. Urinemonsters die na blootstelling aan alfatoxinen werden verzameld, bleken 2,3-dihydroxy-2-(N7-guanyl)-3-hydroxyaflatoxineB1 te bevatten, triviaal bekend als AFB-Gual . Wild et al. (1986) gebruikten hooggevoelige immunoassays om aflatoxinen in menselijke lichaamsvloeistoffen te kwantificeren. Een enzyme linked immunosorbent assay (ELISA) werd gebruikt om aflatoxine B1 te kwantificeren binnen een bereik van 0,01 ng/ml tot 10 ng/ml, en werd gevalideerd in humaneurinemonsters. Met behulp van deze methode bleek de uitscheiding van aflatoxine-DNA-adducten in de urine positief gecorreleerd te zijn met de inname via de voeding, en werd aangetoond dat het belangrijkste aflatoxine B1-DNA-adduct dat in de urine wordt uitgescheiden een geschikte maat is voor het monitoren van de blootstelling aan aflatoxine via de voeding.

Controle en beheer van aflatoxinen

A- Wettelijke controle :

Aflatoxinen worden beschouwd als onvermijdelijke contaminanten van voedsel en veevoer, zelfs wanneer goede productiepraktijken zijn gevolgd. De FDA heeft specifieke richtlijnen opgesteld voor aanvaardbare niveaus van aflatoxinen in menselijk voedsel en diervoeder door actieniveaus vast te stellen die het mogelijk maken overtredende partijen uit de handel te nemen. Het actieniveau voor menselijke voeding is 20 ppb totaal aflatoxinen, met uitzondering van melk waarvoor een actieniveau van 0,5 ppb voor aflatoxine M1 geldt. De actiedrempel voor de meeste diervoeders is ook 20 ppb. Het is echter zeer moeilijk om de aflatoxineconcentratie in een grote hoeveelheid materiaal nauwkeurig te schatten, omdat de testprocedures variabel zijn; daarom kan de werkelijke aflatoxineconcentratie in een partij niet met 100% zekerheid worden bepaald.

B- Ontgiftingsstrategieën :

Omdat aflatoxinebesmetting onvermijdelijk is, zijn er talrijke strategieën voor hun ontgifting voorgesteld. Deze omvatten fysische scheidingsmethoden, thermische inactivering, bestraling, vloeistofextractie, adsorptie uit oplossing, microbiële inactivering en fermentatie. Chemische ontgiftingsmethoden worden ook toegepast als een belangrijke strategie voor een doeltreffende ontgifting:

Structurele afbraak na chemische behandeling :
Een diverse groep chemicaliën is getest op het vermogen aflatoxinen af te breken en te inactiveren. Een aantal van deze chemicaliën kan reageren om aflatoxinen effectief te vernietigen (of af te breken), maar de meeste zijn onpraktisch of potentieel onveilig vanwege de vorming van toxische residuen of de verstoring van het gehalte aan voedingsstoffen en de organoleptische eigenschappen van het product. Twee chemische benaderingen voor de ontgifting van aflatoxinen die veel aandacht hebben gekregen, zijn ammoniak en reactie met natriumbisulfiet.
Vele studies tonen aan dat chemische behandeling via ammoniak een doeltreffende methode kan zijn om met aflatoxine verontreinigde maïs en andere basisproducten te ontgiften. Het mechanisme voor deze actie lijkt hydrolyse van de lactonring en chemische omzetting van de moederverbinding aflatoxine B1 in talrijke producten te omvatten die een sterk verminderde toxiciteit vertonen.
Aan de andere kant is aangetoond dat natriumbisulfiet onder verschillende omstandigheden van temperatuur, concentratie en tijd reageert met aflatoxinen (B1, G1, en M1) om in water oplosbare producten te vormen.

Modificatie van toxiciteit door chemische stoffen in het dieet :
De toxiciteit van mycotoxinen kan sterk worden beïnvloed door chemische stoffen in het dieet die de normale reacties van zoogdiersystemen op deze stoffen veranderen.Een variabele reeks chemische factoren, waaronder voedingsbestanddelen (bv. eiwitten en vetten in de voeding, vitaminen en sporenelementen), additieven in levensmiddelen en diervoeders (bv. antibiotica en conserveringsmiddelen), alsook andere chemische factoren kunnen interageren met de effecten van aflatoxinen bij dieren.

Verbetering van de biologische beschikbaarheid door chemisorbentia voor aflatoxinen :
Een nieuwe benadering van de ontgifting van aflatoxinen is de toevoeging van anorganische sorptiematerialen, bekend als chemisorbentia, zoals gehydrateerd natriumcalciumaluminosilicaat (HSCAS) aan het dieet van dieren. HSCAS heeft het vermogen om aflatoxinen in het maagdarmkanaal van dieren stevig te binden en te immobiliseren, wat resulteert in een aanzienlijke vermindering van de biologische beschikbaarheid van aflatoxinen.

Economische gevolgen van aflatoxinen

De economische gevolgen van aflatoxinen zijn direct toe te schrijven aan oogst- en veesterfte en indirect aan de kosten van regelgevingsprogramma’s om de risico’s voor de gezondheid van mens en dier te beperken. De Voedsel- en Landbouworganisatie (FAO) schat dat 25% van de voedselgewassen in de wereld zijn aangetast door mycotoxinen, waarvan aflatoxinen de bekendste zijn. Aflatoxineverliezen voor vee- en pluimveeproducenten als gevolg van met aflatoxine verontreinigd voeder omvatten sterfte en de meer subtiele effecten van onderdrukking van het immuunsysteem, verminderde groeisnelheid en verlies van voederefficiëntie. Andere nadelige economische gevolgen van aflatoxinen omvatten een lagere opbrengst van voedings- en vezelgewassen.

Bovendien maakt het vermogen van aflatoxinen om kanker en aanverwante ziekten bij de mens te veroorzaken, gezien hun schijnbaar onvermijdelijke aanwezigheid in voedingsmiddelen en veevoeder, de preventie en ontgifting van deze mycotoxinen tot een van de meest uitdagende toxicologische vraagstukken van de huidige tijd.

Anon. 1989. Mycotoxinen, economische en gezondheidsrisico’s. Raad voor Landbouwwetenschap en Technologie, rapport nr. 116, blz. 91.

Eaton, D.L. and Groopman, J.D. 1994. The Toxicology of Aflatoxins. AcademicPress, New York. pp383-426.

Finley, J.W.,Robinson, S.F. and Armstrong, D.J. 1992. Food Safety Assessment.American Chemical Society, Washington, D.C. pp261-275.

Goldbatt, L.A. 1969. Aflatoxin. Academic Press, New York. pp1-40.

Heathcote, J.G. and Hibbert, J.R. 1978. Aflatoxins : Chemical andbiological aspect. Elsevier, New York. pp.173-186.

Liener, I.E. 1969. Toxin constituents of plant foodstuffs. AcademicPress , New york. pp392-394.

Wyllie, T.D. and Morchause,L.G. 1978. Mycotoxin Fungi, Mycotoxins, Mycotoxicoses-An Encyclopedic Handbook.Vols.1,2, and 3.Marcel Dekker, Inc. Newyork.