Dr. Bang was zeer geïnteresseerd in de bloedsomloop van ongewervelden. Hij geloofde dat het bestuderen van dieren waarin de bloedsomloop kon worden geobserveerd, zou leiden tot een beter begrip van de fysiologische processen in gewervelde dieren, zoals de mens.
In het begin van de jaren 1950, toen hij in het Marine Biological Laboratory in Wood’s Hole, Maine, werkte, bestudeerde Bang de bloedsomloop van de degenkrab en zijn reactie op bacteriële infectie.
Hij injecteerde bacteriën, verkregen uit zoet zeewater, in degenkrabben van verschillende grootte en bestudeerde hun reactie. Gewoonlijk zou het bloed een kleine klonter vormen om het besmette gebied af te sluiten en meer bacteriën te verhinderen binnen te dringen.
Maar op een dag merkte Bang dat één van zijn krabben stierf aan een onbekende infectie die bijna het volledige volume van bloed in de krab tot een halfvaste massa had doen stollen.
Dit was nog nooit eerder gezien!
Dus isoleerde en kweekte hij de bacterie van het eerste dier en injecteerde het in andere degenkrabben. Ook deze vertoonden een identieke stolling en stierven.
Bij nader onderzoek ontdekte hij dat alleen “Gram-negatieve” bacteriën deze reactie veroorzaakten.
Note: In 1884, Hans Christian Gram invented a staining procedure for microscopy which came to be called The Gram stain. It stains the bacteria either red (Gram-negative) or violet (Gram-positive) depending on the chemicals they have in their cell walls.
Gram-negatieve bacteriën veroorzaken infecties zoals longontsteking en meningitis. Toen Bang de bacteriën voor de injectie verhitte, kreeg hij nog steeds dezelfde stollingsreactie. Dit betekende dat levende bacteriën niet nodig waren om het bloed van de degenkrab te doen stollen.
Hij publiceerde zijn bevindingen in 1956 en legde zijn eerste waarnemingen bijna 10 jaar naast zich neer.
Enter Jack Levin.
In 1963, terwijl Bang de gegevens van zijn hoefijzerkrabproject besprak, stelde een collega voor dat samenwerking met een hematoloog zou kunnen helpen om het stollingsmysterie te ontrafelen. De collega raadde een onderzoeker uit zijn lab aan, Dr. Jack Levin.
Levin gebruikte konijnen om de Shwartzman Reactie te bestuderen – de reactie op endotoxinen die een klonter in een bloedvat veroorzaakt en ook de functie van gewervelde bloedplaatjes verandert.
Endotoxine is een sleutelcomponent in de celwand van alle Gram-negatieve bacteriën; het kan moeilijk te detecteren zijn en is resistent tegen geneesmiddelen.
Bang haalde Levin over om een zomer door te brengen in het Marine Biological Laboratory in Woods Hole, waar hij de overeenkomsten bestudeerde tussen Limulus amebocyten en menselijke bloedplaatjes.
Hij toonde snel aan dat celvrij plasma van een degenkrab niet zou stollen, maar toen hij de bloedcellen bestudeerde, had hij moeite om het bloed niet te laten stollen.
Hij had nog een ander probleem, ook. Monsters die in orde waren toen hij ‘s avonds het lab verliet, waren gestold toen hij ‘s morgens terugkwam, en geen van de anti-stollingsmiddelen op de markt maakte enig verschil.
Serendipity Leads to an Aha!
Levin was verbijsterd en hij werd een beetje wanhopig om dit uit te zoeken!
Kon het komen door bacteriën of een component van bacteriën?
Om deze mogelijkheid te testen, bereidde hij nieuwe monsters in steriel, endotoxine-vrij glaswerk. Verbazingwekkend genoeg stolde het bloed niet!
Toen realiseerde hij zich dat hij een bloedstollingsmechanisme had geïdentificeerd dat in werking werd gesteld door de aanwezigheid van gramnegatieve bacteriële endotoxine.
Uiteindelijk kon hij aantonen dat het volledige bloedstollingsmechanisme in Limulus was vervat in de amebocyten en uiterst gevoelig was voor de aanwezigheid van endotoxines.
Limulus polyphemus amebocytes
“Ik denk dat alleen een onderzoeker die met endotoxine werkte, ooit de mogelijkheid zou hebben overwogen dat endotoxine het bloed van Limulus deed stollen,” zegt Levin.
Dit leidde ertoe dat Levin de uiterst gevoelige Limulus Amebocyte Lysate (LAL)-test creëerde en patenteerde, waarmee bacteriële endotoxinen konden worden getest met behulp van het bloed van de degenkrab.
De enige andere test voor endotoxinen op dat moment heette de Rabbit Pyrogen Test. In die tijd eiste de US Food and Drug Administration dat alle injecteerbare geneesmiddelen de Pyrogeen-test moesten doorstaan voordat ze voor gebruik konden worden goedgekeurd.
De Konijn Pyrogeen-test was echter een kostbaar, inefficiënt en vaak onnauwkeurig proces.
Je injecteert het monster in een groep konijnen. Als die konijnen koorts kregen, faalde het middel in de test. Als zij geen koorts binnen 4-6 uren kregen, slaagde het.
Pharmaceutische bedrijven moesten duizenden konijnen huisvesten om deze tests uit te voeren.
De LAL-test kan een resultaat in zo weinig zoals 45 minuten teruggeven en kan de aanwezigheid van endotoxins bij niveaus van minder dan één deel per triljoen ontdekken.
Levin realiseerde zich dat hij een zeer gevoelige en snelle test had! Dit was stevige concurrentie voor de konijnentest.
De LAL-test kan een resultaat opleveren in slechts 45 minuten en kan de aanwezigheid van endotoxinen detecteren op niveaus van minder dan één deel per triljoen.
Hoewel de LAL-test in 1965 voor het eerst werd beschreven, duurde het bijna 20 jaar voordat de test officieel door de FDA werd goedgekeurd als endotoxinetest voor eindproducten!
Waarom duurde het zo lang?
Laten we eerlijk zijn, mensen houden er niet van om dingen te veranderen en bedrijven verzetten zich echt tegen verandering. Het aannemen van de nieuwe, gevoeligere test betekende dat farmaceutische bedrijven opnieuw zouden moeten uitrusten en een hele nieuwe productielijn zouden moeten opzetten.
Dat kost tijd en geld!
Maar room stijgt uiteindelijk naar de top; deze test was het neusje van de zalm en is dat nog steeds!
De vraag naar LAL is nu zo hoog dat het een van de meest waardevolle vloeistoffen op aarde is geworden, met een gerapporteerde prijs in april 2018 van tussen de $ 35.000 en $ 60.000 per gallon!
Opschaling van de LAL-test
De LAL-test is uitgeroepen tot een van de “100 belangrijkste bijdragen aan de volksgezondheid” door de Johns Hopkins Bloomberg School of Public Health.
Volgens Jack Levin is het wereldwijd de standaard screeningstest voor endotoxinebesmetting, met ongeveer 17,5 miljoen geteste monsters (wat neerkomt op ruwweg 70 miljoen uitgevoerde tests) per jaar. Het wordt commercieel gebruikt om alle intraveneuze vloeistoffen, parenterale geneesmiddelen en implanteerbare medische hulpmiddelen te testen voordat ze bij patiënten worden gebruikt.
Hoe wordt LAL gemaakt?
Horseshoe crabs worden gevangen en er wordt een buisje in gestoken om hun bloed af te zuigen (zie de foto hierboven). Vervolgens wordt het verzamelde bloed gecentrifugeerd om de amebocyten te concentreren. Door water aan de samengepakte amebocyten toe te voegen, vallen ze uit elkaar en komen de stollingseiwitten (het lysaat) vrij die reageren met de endotoxinen.
Deze manier om LAL te maken wordt aangeprezen als een niet-dodelijke methode om bloed van de krab te verkrijgen. Maar dat is het niet. Omdat niet alle krabben het overleven!
Volgens de Atlantic State Marine Fisheries Commission, in hun 2019 Horseshoe Crab Stock Benchmark Stock Assessment and Peer Review Report, worden 600.000 Hoefijskrabben gevangen en gebloed om aan de jaarlijkse LAL-vraag te voldoen.
Van die 600.000 krabben overleven er ongeveer 420-540.000 (70-90 %) de procedure. Koppel dat aan habitat aantasting, opwarming van de aarde, en nog eens 500.000 + geoogst en gedood elk jaar voor gebruik als aas voor paling en wulk visserij en je kunt zien waarom de hoefijzerkrab populaties instorten.
Niet alleen dat, maar de krabben worden geoogst in mei en juni wanneer ze aan land komen in drommen om te paren, leggen hun eieren en hopelijk onderhouden hun overleving.
Dit is geen duurzame situatie!
Zijn er betere manieren om LAL te maken?
“De Amerikaanse degenkrab overleefde de dinosauriërs en heeft vier eerdere massa-uitstervingen overleefd, maar wordt nu bedreigd door de farmaceutische industrie, visserijgemeenschappen, het verlies van habitats, klimaatverandering en, het meest recent, verstikkende getijden van rode algen voor de oostkust van de Verenigde Staten.”van Jonathan Watts in The Guardian
Er zijn twee primaire inspanningen die worden aangeprezen als manieren om deze ongelukkige situatie te verzachten.
Eén benadering die wordt uitgeprobeerd door de farmaceutische industrie is de aquacultuur van degenkrabben.
In eerste instantie waren de pogingen om degenkrabben te kweken niet erg succesvol. Het bleek dat na 3-4 maanden van kweek, hemolymfe eiwitconcentraties daalden tot niveaus die resulteren in sterfte. Men dacht dat deze sterfte verband hield met voedingstekorten.
Dr. Anthony Dellinger is professor in de afdeling neurowetenschappen aan de Universiteit van North Carolina in Greensboro en wetenschapper bij Kepley Biosystems Incorporated, Greensboro, NC.
Dellinger en KBI zijn hard aan het werk geweest om een nieuw, verbeterd aquacultuursysteem te ontwikkelen. Hun uitgangspunt is dat “gecontroleerde verzameling van LAL van gecontroleerde en goed onderhouden degenkrabben in aquacultuur hoeveelheden LAL zou kunnen verhogen, levensvatbaarheid van de soort verzekeren, en nieuwe klinische innovaties mogelijk maken.”
Indien succesvol, zou het produceren van grotere hoeveelheden LAL betrouwbaar, duurzaam, en economisch zowel de natuur als de industrie ten goede komen.
Dellinger en collega’s beschreven in detail hoe hun aquacultuursysteem werkt in een paper gepubliceerd in Frontiers of Marine Science afgelopen april.
Laten we eens kijken naar de hoogtepunten en resultaten van die studie.
Voreerst optimaliseerden ze een indoor recirculerend aquacultuursysteem dat op betrouwbare wijze de degenkrabben onderhoudt. Hun doel was om repetitieve LAL-oogst te vergemakkelijken met behoud van het welzijn van de dieren.
De volgende mijlpaal was het bereiken van een methode voor low-impact repetitieve oogst. Om dit te doen implanteerden zij chirurgisch een katheter in de degenkrab. Uit al hun tests bleek dat de degenkrabben deze katheters vrij goed verdroegen.
Hier volgt een korte samenvatting van hun resultaten.
Zij oogstten en onderhielden 24 krabben gedurende één jaar met 100% overleving. De degenkrabben werden gecontroleerd op LAL-activiteit, het vrijkomen van eieren en sperma en andere tekenen die zouden kunnen wijzen op een verminderde gezondheid. Dergelijke tekenen werden niet waargenomen.
De krabben bloedden ongeveer drie keer per maand uit de katheters, wat neerkomt op ongeveer 36 bloedingen per krab over de periode van 12 maanden. Er werden geen problemen ondervonden van de geïmplanteerde katheters gedurende deze periode.
Toen zij de kosten berekenden, buiten de aanvankelijke opzet voor het aquacultuursysteem, kwam het onderhoud van de krabben op ongeveer $0,76 per pond, een zeer betaalbaar bedrag!
De belangrijkste vraag die beantwoord moest worden was:
Hoe verhoudt zich het LAL van de in eigen beheer gehouden degenkrabben tot dat van vers geoogste krabben?
Zoals te zien is in figuur 6 van hun paper, was er geen significant verschil in LAL endotoxine stollingsactiviteit tussen de in aquacultuur gekweekte en wilde krabben. En er was ook geen echt verschil in de activiteit van bloedingen genomen op dagen 1, 16 en 23.
Deze resultaten leidden hen tot de conclusie,
“…aquacultuur zou kunnen voldoen aan de behoeften van de industrie voor meerdere jaren met het equivalent van 5-10% van de jaarlijkse vangst van een jaar, waardoor bijna 600.000 HSCs in het wild elk jaar daarna. In feite suggereren deze bevindingen dat ∼60.000 aquacultuur HSC’s 12-24 keer per jaar duurzaam zouden kunnen worden gebloed en de huidige biomedische vraag naar LAL zouden overtreffen.”
De tweede benadering elimineert de behoefte aan krabben volledig.
Jeak Ling Ding, samen met haar echtgenoot en onderzoekspartner Bow Ho, in Singapore, had een doel – de behoefte aan degenkrabben volledig elimineren.
Zij bestudeerde Carcinoscorpius rotundicauda, een Aziatische soort die veel kleiner was dan Atlantische degenkrabben, en ze konden niet veel bloeden zonder te sterven.
Ding’s onderzoek naar LAL leidde tot de ontdekking dat een molecuul genaamd factor C verantwoordelijk was voor zijn stollende werking. Ding isoleerde het gen voor factor C en gebruikte een virus om het in de darmcellen van insecten in te brengen. Dit veranderde de insecten in kleine fabriekjes die factor C produceerden.
De gemodificeerde insecten maken voldoende hoeveelheden factor C, die vervolgens als recombinant* factor C (rFC) op de markt konden worden verkocht als een levensvatbaar substituut voor LAL.
* Note: The word recombinant is a term used in molecular genetics to indicate a gene that has been isolated (cloned) and inserted into another organism's DNA so that organism makes the protein that gene specifies. Using a virus is one of many ways to accomplish this.
Dus nu, in plaats van hoefijzerkrabben te oogsten of te aquaculturen en ze te laten bloeden, zouden ze grote hoeveelheden insecten kunnen kweken en de rFC isoleren.
Farmaceutische bedrijven die rFC hebben gebruikt, hebben bevestigd dat het net zo goed werkt als LAL en dat de productiekosten vergelijkbaar zijn.
“We waren gewoon zo enthousiast als onderzoekers, zo blij dat het werkt,” zei Ding. “En we dachten dat de recombinante factor C over de hele wereld zou worden ingevoerd en dat de degenkrab zou worden gered.”
Helaas werd rFC bij de introductie geconfronteerd met dezelfde obstakels voor de acceptatie als LAL. Hoewel rFC al sinds 2003 op de markt is, is het traag op gang gekomen. Maar beetje bij beetje overwint het de obstakels voor goedkeuring door de FDA. Oorspronkelijk produceerde slechts één fabrikant het – het in Zwitserland gevestigde chemiebedrijf, de Lonza Group.
In 2013 werd Hyglos GmbH het tweede bedrijf dat rFC maakte. Kevin Williams, een senior wetenschapper bij Hyglos, zegt dat hij de opname en goedkeuring van rFC als lang over tijd ziet. Hyglos GmbH heeft verkregen goedkeuring voor het gebruik ervan door verschillende Europese regelgevende instanties.
Vandaag, deskundigen geloven dat uiteindelijk, rFC zal de dominante methode voor het detecteren van endotoxinen worden, waardoor de hoefijzerkrabben volledig uit de industriële productie haak.
Nu, dat is iets waar de degenkrab mee kan leven!
Note: In these times of COVID-19, I wouldn't be surprised to see the obstacles removed even faster. Taking and applying research knowledge to improve patient wellbeing is happening faster than ever before. And in cases like this, that's a really good thing!
Dat brengt ons bij de laatste vraag die ik wil bekijken:
Waarom maken we ons eigenlijk druk of de degenkrab overleeft?
Zijn het niet gewoon oude relikwieën waar ons moderne ecosysteem gemakkelijk zonder kan? Veel andere soorten zijn uitgestorven en de planeet lijkt in orde.
Dat is een terechte vraag, dus laten we er eens wat dieper op ingaan.
De voorspelbare reactie is, “natuurlijk willen we ze redden!” We hebben genoeg wezens op deze planeet die al bedreigd zijn of al uitgestorven zijn. We kunnen het ons gewoon niet veroorloven er nog meer te verliezen.
Zoals ik al zei, dat is meer een onderbuikreactie, niet een antwoord waar je je hoed aan kunt ophangen. Voor een beter antwoord moeten we kijken naar hoe de degenkrab in het grote plaatje past.
Laten we beginnen met wat ze eten en wat hen eet.
De volwassen degenkrab jaagt op kleine weekdieren zoals de blauwe mossel en de surf clam, en annelid wormen.
Met ingang van 2017, zijn blauwe mosselen niet in ernstig gevaar volgens dit rapport van The Safina Center aan de Stony Brook University. Hetzelfde geldt voor zowel de anneliden als de surf clams.
Juvenielen voeden zich met kleine deeltjes van zowel algen als dierlijk materiaal. Naarmate het dier in omvang toeneemt, neemt ook de prooi toe die het consumeert.
Over het geheel genomen, lijkt het erop dat de degenkrab geen nadelige effecten heeft op hun prooisoorten.
Ok, dat is één kant van de medaille. Hoe zit het met de andere? Wat eet de degenkrab?
Eieren van de degenkrab zijn een voedselbron voor veel organismen.
Daartoe behoren kustvogels, sommige vissen – gestreepte zeebaars, gestreepte killifish, silversides, bot – maar ook zeeschildpadden, krabben, en wulken. Ze vormen een essentiële voedselbron voor 11 soorten trekkende kustvogels. Het verlies van deze eieren zou deze vogelpopulaties verwoesten.
Schildpadden en kustvogels zoals de rode knoop zijn afhankelijk van de degenkrabben.
Duizenden van deze schildpadden migreren naar de Chesapeake en Delaware Bay in de zomer om zich te voeden met de krabben. Er wordt nu gedacht dat de Onechte karetschildpadden lijden onder een gebrek aan degenkrabben in de Chesapeake.
Een paar anekdotes melden dat degenkrabben opduiken in de buik van alligators en haaien.
De jongen van de Onechte karetschildpad zouden ook een sleutelvoedsel in het voedselweb van de kust kunnen zijn. Gedurende de zomer en de herfst, zwermen de larven en de vroege levensstadia van de degenkrab over het ondiepe water. Deze hapjes worden ongetwijfeld opgeslokt door vissen en kustvogels.
En het lijkt erop dat er veel andere dieren zijn die ze heel smakelijk vinden en het moeilijk zouden hebben om gemakkelijke vervangers te vinden.
Voor een schepsel dat al 450 miljoen jaar bestaat, is ons begrip verre van volledig over de rol die Limulus polyphemus in het kustecosysteem speelt.
Met de huidige stand van onze kennis van de ecologie van de degenkrab, kunnen wij niet definitief tot conclusies komen over hoe essentieel hun rol is. Wat we kunnen zeggen is dat ze zeker een niche die rechtvaardigt meer serieuze studie.
Zelfs zo, ik kom aan de kant voor de noodzaak om ze te behouden! Het is mijn “better safe than sorry” houding. We weten gewoon te weinig om een soort als Limulus polyphemus door onze vingers te laten glippen en te verdwijnen als we het kunnen voorkomen.
Zo, is er iets wat je kunt doen?
Als je toevallig in de buurt woont van een plaats waar de degenkrabben komen om eieren te leggen, is het gemakkelijk om te werpen en te helpen. Er zijn krab flipping programma’s en paaiende krab onderzoeken die afhankelijk zijn van vrijwilligers.
En tot slot, vergeet niet de degenkrab als je naar de dokter gaat. Alles wat wordt geïnjecteerd of geïmplanteerd in ons lichaam wordt nog steeds getest op gram-negatieve bacteriële besmetting met LAL gemaakt van hoefijzerkrab bloed.
Tot de volgende keer
Rich
Hey! Als je dit artikel leuk vond, schrijf je dan in voor mijn nieuwsbrief en ontvang een gratis ebook!
Voor dit artikel gebruikte informatiebronnen:
- De Hoefijzerkrab
- Horseshoe Crab Aquaculture as a Sustainable Endotoxin Testing Source
- The Role of Horseshoe Crabs in the Biomedical Industry and Recent Trends Impacting Species Sustainability
- The Last Days of the Blue-Blood Harvest
- The Underwater Secrets of Horseshoe Crabs
- Deze krab kan uw leven redden – als de mens hem niet eerst uitroeit
- NJ heeft de vangst van de degenkrab beëindigd. Moeten andere staten hetzelfde doen?
- De website over de Hoefijzerkrab is gemaakt door Kayla Westerlund
- De Atlantische Hoefijzerkrab