ImmunohistochemieEdit
Immunohistochemie of IHC-kleuring van weefselsecties (of immunocytochemie, dat is de kleuring van cellen), is misschien wel de meest toegepaste immunokleuringstechniek. Terwijl in de eerste gevallen van IHC-kleuring gebruik werd gemaakt van fluorescente kleurstoffen (zie immunofluorescentie), worden nu andere niet-fluorescerende methoden gebruikt waarbij enzymen zoals peroxidase (zie immunoperoxidase-kleuring) en alkalische fosfatase worden gebruikt. Deze enzymen zijn in staat reacties te katalyseren die een gekleurd product opleveren dat gemakkelijk met lichtmicroscopie kan worden waargenomen. Als alternatief kunnen radioactieve elementen worden gebruikt als labels, en de immunoreactie kan worden gevisualiseerd door autoradiografie.
Weefselvoorbereiding of -fixatie is essentieel voor het behoud van de celmorfologie en de weefselarchitectuur. Onjuiste of langdurige fixatie kan het vermogen om antilichamen te binden aanzienlijk verminderen. Veel antigenen kunnen met succes worden aangetoond in met formaline gefixeerde, in paraffine ingebedde weefselcoupes. Sommige antigenen overleven echter zelfs matige hoeveelheden aldehydefixatie niet. Onder deze omstandigheden moeten weefsels snel vers worden ingevroren in vloeibare stikstof en worden uitgesneden met een cryostaat. De nadelen van diepgevroren coupes zijn een slechte morfologie, een slechte resolutie bij hogere vergrotingen, moeilijkheden bij het snijden over paraffinepreparaten en de noodzaak van diepvriesopslag. Bij vibratome doorsneden daarentegen hoeft het weefsel niet te worden bewerkt met organische oplosmiddelen of grote hitte, die de antigeniciteit kunnen vernietigen, of te worden verstoord door vriesdooi. Het nadeel van vibratome doorsneden is dat het doorsnijdingsproces traag en moeilijk is bij zachte en slecht gefixeerde weefsels, en dat er vaak klapperende sporen of vibratome lijnen zichtbaar zijn in de doorsneden.
De opsporing van veel antigenen kan drastisch worden verbeterd door antigeenretrievalmethoden die werken door sommige van de door fixatie gevormde eiwitcrosslinks te verbreken om verborgen antigene plaatsen bloot te leggen. Dit kan worden bereikt door verhitting gedurende verschillende tijden (heat induced epitope retrieval of HIER) of met behulp van enzymatische digestie (proteolytic induced epitope retrieval of PIER).
Een van de grootste moeilijkheden bij IHC-kleuring is het overwinnen van specifieke of niet-specifieke achtergrond. Optimalisering van de fixatiemethoden en -tijden, voorbehandeling met blokkeermiddelen, incubatie van antilichamen met een hoog zoutgehalte en optimalisering van de wasbuffers en wastijden na het wassen van antilichamen zijn allemaal belangrijk voor het verkrijgen van immunokleuring van hoge kwaliteit. Bovendien is de aanwezigheid van positieve en negatieve controles voor kleuring essentieel voor het bepalen van specificiteit.
FlowcytometrieEdit
Een flowcytometer kan worden gebruikt voor de directe analyse van cellen die een of meer specifieke eiwitten tot expressie brengen. Cellen worden in oplossing geïmmuniseerd met methoden die vergelijkbaar zijn met die welke worden gebruikt voor immunofluorescentie, en vervolgens geanalyseerd met behulp van flowcytometrie.
Flowcytometrie heeft verschillende voordelen boven IHC, waaronder: de mogelijkheid om verschillende celpopulaties te definiëren op basis van hun grootte en korrelgrootte; de mogelijkheid om dode cellen uit te sluiten; verbeterde gevoeligheid; en meerkleurenanalyse om verschillende antigenen tegelijk te meten. Flowcytometrie kan echter minder doeltreffend zijn bij het opsporen van uiterst zeldzame celpopulaties, en er is een verlies van architectonische relaties bij afwezigheid van een weefseldoorsnede. Flowcytometrie heeft ook een hoge kapitaalkosten in verband met de aanschaf van een flowcytometer.
Western blottingEdit
Western blotting maakt de detectie van specifieke eiwitten uit extracten gemaakt van cellen of weefsels mogelijk, voor of na eventuele zuiveringsstappen. Eiwitten worden in het algemeen op grootte gescheiden met behulp van gelelektroforese voordat ze worden overgebracht op een synthetisch membraan via droge, halfdroge of natte blottingmethoden. Het membraan kan vervolgens worden gesondeerd met antilichamen volgens methoden die vergelijkbaar zijn met immunohistochemie, maar zonder dat fixatie nodig is. Detectie wordt meestal uitgevoerd met peroxidase gekoppelde antilichamen om een chemiluminescente reactie te katalyseren.
Western blotting is een routine moleculair-biologische methode die kan worden gebruikt om semi-kwantitatief eiwitniveaus tussen extracten te vergelijken. De grootte scheiding voorafgaand aan blotting maakt het mogelijk om het eiwit molecuulgewicht te meten in vergelijking met bekende moleculaire gewicht markers.
Enzyme-linked immunosorbent assayEdit
De enzyme-linked immunosorbent assay of ELISA is een diagnostische methode voor het kwantitatief of semi-kwantitatief bepalen van eiwitconcentraties uit bloedplasma, serum of cel-/weefselextracten in een multi-well plaatformaat (meestal 96-wells per plaat). In het algemeen worden eiwitten in oplossing geadsorbeerd aan ELISA-platen. Antilichamen die specifiek zijn voor het betrokken eiwit worden gebruikt om de plaat te onderzoeken. Achtergrond wordt geminimaliseerd door de blokkeer- en wasmethoden te optimaliseren (zoals voor IHC), en specificiteit wordt verzekerd door de aanwezigheid van positieve en negatieve controles. Detectiemethoden zijn gewoonlijk colorimetrisch of op chemiluminescentie gebaseerd.
Immuno-elektronenmicroscopieEdit
Elektronenmicroscopie of EM kan worden gebruikt om de gedetailleerde microarchitectuur van weefsels of cellen te bestuderen. Met immuno-EM kunnen specifieke eiwitten in ultradunne weefselcoupes worden gedetecteerd. Antilichamen die gelabeld zijn met deeltjes van zwaar metaal (b.v. goud) kunnen rechtstreeks gevisualiseerd worden met transmissie-elektronenmicroscopie. Hoewel immuno-EM zeer geschikt is voor de detectie van de subcellulaire lokalisatie van een eiwit, kan het een technische uitdaging vormen, duur zijn en een rigoureuze optimalisatie van de fixatie- en verwerkingsmethoden voor het weefsel vereisen. Biotinylering van eiwitten in vivo werd voorgesteld om de problemen te verlichten die worden veroorzaakt door frequente incompatibiliteit van antilichaamkleuring met fixatieprotocollen die de celmorfologie beter bewaren.