Discussie

De menselijke microbiota omvat meer dan duizend verschillende bacteriesoorten en speelt een belangrijke rol in de menselijke gezondheid door de toevoer van voedingsstoffen te bevorderen, de kolonisatie van pathogenen te voorkomen en de normale immuniteit van de slijmvliezen te vormen en in stand te houden. Onlangs is gebleken dat de darmbacteriën in de omgeving een echte symbiotische relatie hebben met de gastheer; binnen deze grote groep bacteriën wordt van probiotische supplementen met LAB (d.w.z. Lactobacillen en Bifidobacteriën) beweerd dat zij een aantal gunstige effecten hebben op de menselijke gezondheid, zoals de preventie van diarree en inflammatoire darmziekten of de profylaxe van urogenitale infecties. Onze kennis van de biochemische rol die specifieke soorten en stammen spelen in de menselijke gezondheid en ziekte is echter zeer beperkt. In deze studie hebben wij getracht meer inzicht te krijgen in de nitraatreductieroutes in geselecteerde veel voorkomende bacteriesoorten die de menselijke darm koloniseren, met gebruikmaking van in vitro-omstandigheden die compatibel zijn met nitraatrijke diëten en zuurstofniveaus die worden aangetroffen op de mucosale oppervlakken van het maagdarmkanaal. De voornaamste bevindingen van ons onderzoek wijzen uit dat: 1) E.coli, een facultatief anaërobe bacterie, zet nitraat om in nitriet en vervolgens in ammoniak, dat zich geleidelijk ophoopt in de cultuurmedia; 2) L.plantarum, een fermentatieve bacterie, gekweekt in aanwezigheid van exogeen heem en vitamine K2, voert soortgelijke processen uit; 3) E.coli-enzymen genereren alleen onder anaërobe omstandigheden een aanzienlijke hoeveelheid NO uit nitriet; 4) alle onderzochte LAB-culturen produceren grote hoeveelheden melkzuur, waardoor de cultuurmedia voldoende worden aangezuurd om de disproportionele omzetting van nitriet in NO te bewerkstelligen.

De meeste eukaryoten ontlenen hun energie hoofdzakelijk door oxidatieve fosforylering en moeten O2 inademen voor de vorming van ATP, maar veel enterische bacteriën, waaronder E.coli K12 stammen, kunnen NO3- gebruiken als alternatieve elektronenacceptor wanneer O2 beperkt is en nitraat in overvloed aanwezig is. E.coli is het modellid van de Enterobacteriaceae en hoewel deze familie slechts een klein deel van de darmmicrobiota uitmaakt, is zij van bijzonder belang omdat bepaalde stammen ziekten kunnen veroorzaken. Onlangs is ook aangetoond dat nitraat, dat ontstaat als bijproduct van ontsteking van de gastheer, door E.coli tijdens de ademhaling kan worden gebruikt om groei te bevorderen en microben in het colon te verdringen die alleen op fermentatie zijn aangewezen. L. plantarum wordt beschouwd als een veilig probioticum en wordt algemeen aangetroffen in het darmkanaal van zoogdieren en in het speeksel van de mens, waarvan bekend is dat nitraten zich ophopen tot millimolaire niveaus als gevolg van de entero-salivaire nitraatcyclus, die goed is voor ongeveer 25% van het totale circulerende nitraat. Deze bacterie vertoont de typische facultatieve heterofermentatieve route van de LAB-familie, maar, uniek voor deze soort, genen die coderen voor een vermoedelijk nitraatreductasesysteem (narGHJI) werden onlangs geïdentificeerd in het L. plantarum WCFS1-genoom, wat suggereert dat het in staat is nitraat te gebruiken als een elektronenacceptor . Een recent gepubliceerde genetische analyse van L. plantarum heeft inderdaad zijn enorme diversiteit en veelzijdigheid van zijn metabolisch vermogen aangetoond.

In onze experimenten werd zowel in E.coli als in L. plantarum een significante nitraatreductase activiteit waargenomen naarmate de zuurstofspanning van atmosferisch niveau naar nul daalt. B.longum infantis daarentegen, een micro-aero tolerante anaërobe bacterie afkomstig van het maagdarmkanaal van zuigelingen, toonde geen vermogen om nitraat te reduceren, zelfs niet bij hoge concentraties. Bifidobacteriën vertegenwoordigen tot 90% van de bacteriën van het maagdarmkanaal van een zuigeling en onze resultaten zijn in overeenstemming met de waarneming dat moedermelk, die bijzonder hoge nitrietgehalten bevat, een voedingsbron voor nitriet vormt voordat de linguale en darmmicrobiota die in staat zijn nitraat te verminderen en die normaal in de volwassen flora worden aangetroffen, zich kunnen vestigen.

In fig. 1 toonden we aan dat E.coli-culturen met 5 mM NO3- een competitief groeivoordeel hadden ten opzichte van culturen waaraan geen nitraat was toegevoegd, en vervolgens bepaalden we het effect van zuurstof- en nitraatgradiënten op de productie van nitriet en ammoniak. Uit onze resultaten blijkt dat ongeveer 2,5 mM NO3- bij 4% of minder O2 voldoende is om de expressie van nitraatreductase-enzymen te induceren en dat na 24 uur een aanzienlijke hoeveelheid nitriet zich zowel in de E.coli-cellen als in de kweekmedia heeft opgehoopt. Een gedetailleerde moleculaire analyse van de regulatie van de bacteriële enzymatische activiteiten valt buiten het bestek van deze studie, maar het is bekend dat E.coli K12 stammen drie molybdeen-bevattende nitraatreductases tot expressie brengen en dat wolfraam deze enzymen kan deactiveren door het molybdeenatoom op de actieve plaats te vervangen. We ontdekten dat de toevoeging van 300 μM wolfraamoxide aan culturen gekweekt zoals in experimenten gerapporteerd in Fig. 1 de vorming van nitriet bijna volledig deed verdwijnen (gegevens niet getoond). Wij denken dus dat molybdeenafhankelijke nitraatreductases verantwoordelijk zijn voor de cruciale stap in de vorming van nitriet. Het is ook belangrijk op te merken dat E.coli, evenals vele andere bacteriesoorten, gevoelig zijn voor nitrietvergiftiging als gevolg van de vorming van metaal-nitrosylcomplexen en dat zij deze toxiciteit minimaliseren door de gecoördineerde inductie van een nitrietmembraantransporter en andere enzymen die de nitrietreductie bemiddelen. Een volledige beschrijving van de E.coli nitraat en nitriet reductase enzymen en operons regulatie en expressie is te vinden in uitstekende publicaties van Stewart en Cole.

Nitrogen oxides reduction pathways in the human gut

De aanwezigheid van nitraat en nitriet in de lagere GI tract hangt af van talrijke aspecten, waaronder de soorten bacteriën die de darm koloniseren en het ingewikkelde evenwicht tussen voeding en de stikstof oxiden metabolische routes. Het is echter al lang bekend dat de endogene productie van nitraat door oxidatie van NO (voornamelijk via reactie met oxy-hemoglobine) een orde van grootte groter is dan de inname via de voeding, zoals eind jaren zeventig is aangetoond en meer recentelijk in studies met eNOS-deficiënte muizen. In de schematische voorstelling van fig. 5 is het verband samengevat tussen bacteriële respiratoire denitrificatie, de reductie van stikstofoxiden tot ammoniak, de endogene L-arginine/NO synthase-route en de niet-enzymatische nitrietreductie tot NO. In het denitrificatieproces (rood kader) wordt nitraat gereduceerd tot stikstofgas (N2) in een proces van vier stappen waarbij nitriet, NO en distikstofoxide elektronenacceptoren zijn in energieopwekkende reacties. Onlangs is aangetoond dat er een volledige denitrificatie-route, die leidt tot de productie van N2, bestaat in menselijke tandplaque. Hoewel deze route bij de mens nog steeds van ondergeschikt belang wordt geacht, speculeren wij dat deze een belangrijke rol zou kunnen spelen bij een zeer lage zuurstofspanning in aanwezigheid van nitraat en dat de vorming van N2 in de menselijke darm niet kan worden uitgesloten. Denitrificatie en dissimilatoire nitraatreductie tot ammoniak (DNRA, blauw kader) hebben de eerste nitraat-nitrietreductiestap gemeen en verschillende klassen nitraatreductases zijn met deze reactie in verband gebracht. Bij DNRA is de tweede stap de directe reductie van nitriet tot ammoniak met zes elektronen, die geen energie oplevert maar een vrij gangbaar ontgiftingsproces is bij facultatief anaërobe bacteriën. Er is geopperd dat DNRA de belangrijkste route is voor het nitraatmetabolisme in de pens van zoogdieren. Deze studie identificeerde ammoniak als een product van nitraatreductie in E.coli en Lactobacilli bacteriën gekweekt in de aanwezigheid van mM nitraat bij 4% zuurstof of lager.

Expand

Respiratoire denitrificatie kan ook kleine maar relevante hoeveelheden NO als tussenproduct genereren en is betrokken bij de bacteriële NO-productie in de darm . Andere mogelijke routes waarbij NO vrijkomt zijn de zure omzetting van nitriet (groen kader) en de oxidatie van L-arginine door NOS-enzymen (bruine cirkel). In fig. 4C hebben wij de protonafhankelijkheid van de niet-enzymatische disproportionering van nitriet onderzocht en aangetoond dat deze alleen relevant wordt wanneer de pH van de intracellulaire of lichaamsvloeistoffen lager is dan 5,5. Onze resultaten sluiten ook de aanwezigheid van actieve NOS-enzymen in E.coli en L.plantarum uit, maar van darmepitheelcellen is bekend dat zij NO produceren door expressie van zowel de endotheliale als de induceerbare NOS-isovormen. Interessant is dat de NO-productie in de darm ook op gang kan worden gebracht door de enzymatische processen van peroxidasen, die overvloedig aanwezig zijn op de cellen van het darmslijmvlies en waarvan is aangetoond dat zij nitriet als substraat gebruiken om NO te produceren als onderdeel van hun antibacteriële werking.

Wij denken dat al deze verschillende nitraatreductieroutes naast elkaar kunnen bestaan en gelijktijdig kunnen voorkomen, maar het is waarschijnlijk dat slechts één metaboliet de overhand heeft, afhankelijk van de specifieke fysiologische omstandigheden.

Fysiologische betekenis van NO-vorming door bacteriële nitraatreductie

Nitraat en nitriet in de voeding worden in veel studies nog steeds afgeschilderd als mogelijk toxische stoffen, ondanks het toenemende bewijs dat de NO-productie uit deze ionen belangrijke gunstige implicaties heeft voor cardiovasculaire, immuun- en gastro-intestinale functies . In de darm vervult NO verschillende fysiologische functies, zoals de regulering van de mucosale doorbloeding, de intestinale mobiliteit en de slijmdikte. De chronische overproductie van NO is ook in verband gebracht met inflammatoire darmziekten en remt waarschijnlijk de groei van een grote verscheidenheid van bacteriële soorten. Eerdere studies lieten onduidelijk hoe darmbacteriën NO produceerden, maar Sobko et al. toonden aan dat in tegenstelling tot conventionele ratten, NO-niveaus in de darm van kiemvrije ratten extreem laag zijn en wanneer geïnoculeerd met normale bacterieflora de waargenomen NO-productie 10-voudig toenam.

In onze experimenten bepaalden zuurstof- en protonconcentraties de specifieke route van nitraatreductie tot NO. Uit de resultaten in fig. 4A blijkt dat E.coli in staat is tot enzymatische NO-activiteit onder anaërobe omstandigheden met nitraatconcentraties van meer dan 1 mM, mogelijk via denitrificatie of het periplasmatische cytochroom c nitrietreductase enzym (Nrf) zoals voorgesteld door Corker en Poole . Deze NO-generatie wordt echter sterk gereduceerd bij 2% zuurstof en wordt nitraatonafhankelijk. Belangrijk is dat onze gegevens consistent zijn met het rapport van Sobko en collega’s dat E. coli onbeduidende NO-niveaus genereerde gedurende 24 uur incubatie met 0,1 mM nitraat. LAB produceerde aanzienlijke hoeveelheden NO in reactie op de verzuring van de media als gevolg van de accumulatie van melkzuur. Vervanging van de groeimedia door vers LMRS (pH = 6,5) blokkeerde bijna volledig het vermogen van de LAB-culturen om nitriet om te zetten in NO, maar niet bij E.coli. Metingen van de pH in de darm variëren tussen 5,7 en 7,5, zodat in vivo nitriet disproportionering waarschijnlijk een klein en gelokaliseerd aspect is van de NO productie. Omgekeerd is deze weg een welbekend verschijnsel in het zure milieu van de maag (pH ongeveer 3).

Samenvattend suggereren wij dat het NO dat door darmbacteriën in de nabijheid van het darmslijmvlies wordt gegenereerd, ofwel de gunstige effecten kan uitoefenen die hierboven zijn vermeld, ofwel bij hogere niveaus deze functies kan verstoren. Aldus kan bacteriële NO-vorming in de darm worden beschouwd als modulator van zowel fysiologische als pathologische effecten.

Fysiologische implicaties van bacteriële ammoniakvorming voor de gezondheid

Colonische bacteriën produceren ammoniak door deaminatie van aminozuren of via urease, de hydrolyse van ureum in koolstofdioxide en ammoniak sinds de baanbrekende studies van Vince et al. in het begin van de jaren 1970. Meer recent meldden Cole en collega’s dat het voornaamste product van nitrietreductie in E.coli ammoniak is, waarvan slechts 1% wordt gereduceerd tot NO bij neutrale pH. De in onze studie verkregen resultaten suggereren dat ten minste bepaalde gewone darmbacteriën nitriet primair reduceren tot ammoniak in plaats van NO. Bij gezonde personen wordt, onder normale fysiologische omstandigheden, het grootste deel van de ammoniak die in het lagere maagdarmkanaal wordt geproduceerd, vervolgens uitgescheiden in de lichaamsvloeistoffen en gemetaboliseerd door de leverhepatocyten, waar ammoniak en kooldioxide enzymatisch worden omgezet in carbamoylfosfaat, dat de reeks reacties ingaat die de “ureumcyclus” wordt genoemd en leidt tot de vorming van ureum en de eliminatie daarvan door de nier (zie fig. 5). De normale plasmaconcentratie van ammoniak ligt tussen 10-35 μM, maar wanneer de ammoniakproductie te hoog is, kan het door het bloed vervoerde ammoniak langs de lever passeren, wat tot hyperammonemie leidt. Ammoniak in het bloed dringt vrij door de bloed-hersenbarrière en hoge concentraties (>100 μM) hebben toxische effecten op het centrale zenuwstelsel, wat tot encefalopathie en uiteindelijk coma leidt. Patiënten met levercirrose ontwikkelen zeer vaak hepatische encefalopathie (HE) . Als er geen sprake is van leverfalen, wordt hyperammonemisch coma toegeschreven aan sepsis door micro-organismen die in staat zijn tot urease, zoals Klebsiella pneumonia. De klassieke therapeutische aanpak van HE bestaat uit de verlaging van het systemische ammoniakgehalte door een antibioticumbehandeling (om de intestinale ammoniakproducerende bacteriën te doden) en de toediening van niet-absorbeerbare suikers, zoals lactulose en lactitol . In de dikke darm wordt lactulose door de werking van colonbacteriën afgebroken, hoofdzakelijk tot melkzuur, en ook tot kleine hoeveelheden mierenzuur en azijnzuur. Deze verzuring bevordert de vorming van het niet-opneembare ammoniumion uit ammoniak en verlaagt de ammoniumconcentratie in plasma. Het is onduidelijk in welke mate nitraat uit de voeding bijdraagt aan de ammoniakconcentratie in de darm en het bloed, maar wij stellen de alternatieve hypothese voor dat de verhoogde verzuring van de coloninhoud door de aanwezigheid van lactulose de omzetting van nitriet in NO door de microbiota bevordert in plaats van ammoniak door het bekende zuur-afhankelijke mechanisme.

Conclusies

Gedurende meer dan 30 jaar kon het biologische lot van exogeen nitraat niet worden verantwoord in de uitgescheiden stikstofhoudende verbindingen die ongeveer 60% bedragen van een ingenomen nitraatdosis bij de mens. Onze resultaten ondersteunen het idee dat nitraat wordt omgezet in nitriet en vervolgens in andere gereduceerde stikstofbiomoleculen zoals NO, ammoniak, ureum en mogelijk stikstofgas door bacteriën in het speeksel, de maag, de dunne en de dikke darm. Vragen zoals hoeveel ammoniak wordt gegenereerd uit de nitraat-nitrietreductie versus andere belangrijke processen, zoals deaminatie en de activiteit van bacteriële ureasen, vereisen gedetailleerde metabole studies bij dieren en/of mensen. De biologische betekenis van de omzetting van nitraten uit de voeding in het darmlumen moet nog worden vastgesteld. De traditionele Japanse en mediterrane diëten, waarvan bekend is dat zij een cardiovasculair beschermend effect hebben, hebben echter een gemiddelde nitraatinname per persoon die 2 tot 3 maal hoger is dan de typische westerse voeding (in de Verenigde Staten overeenkomend met ongeveer 40-100 mg nitraat per dag). Verder onderzoek naar het verband tussen symbiotische bacteriën, het stikstofoxidemetabolisme en de menselijke gezondheid is nodig; het is echter duidelijk dat de biologische routes van het stikstofmetabolisme bij zoogdieren complexer en belangrijker zijn dan zelfs maar een paar jaar geleden werd gedacht.